Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for venligt at give plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for venligt at give en højhastighedskøling centrifuge. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og blev delvist støttet af det førende initiativ for fremragende unge forskere, MEXT, Japan.

1. Forbered medier og buffere.
<ol><li>Forbered 2xYTPG medium.<ol>
<li>Bland 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumphosphat monobasisk, 13,93 g kaliumphosphat dibasic og deioniseret vand til 2 L.</li>
		<li>Autoklave på flydende cyklus med en eksponeringstid på 30 min14.</li>
		<li>Til 400 mL 2xYTP-medier fra 1.1.2 tilsættes 7,2 g D-glukose (dextrose) og blandes, indtil det er opløst.</li>
		<li>Filtersterilaliseres gennem et 0,2 μm filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered S30A buffer.<ol>
<li>Blan...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her, giver meget aktivt bakterielt lysat til cellefri genekspression. Nøglen er at bruge celler, der bærer plasmid pAD-LyseR, som udtrykker lambda phage endolysin kytosolically. Disse celler er potentiated at lyse sig selv på permeabilization af den indre membran, så endolysin adgang til cellevæggen, som metoden opnår gennem en simpel fryse-optø cyklus. Fordi cellerne effektivt lyse sig selv, produktet kaldes autolysate. Efter at cellerne har tændt, er de eneste tilbageværende trin...

Genekspression i cellefrie lysater har flere fordele ved at bruge levende celler1,2,3,4. Lysater kan let ændres biokemisk og anvendes under forhold, der kan være skadelige for eller umulige at opnå i levende celler. Genekspression kredsløb behøver ikke at kæmpe eller konkurrere med vært biologiske processer, og afprøvning af nye genetiske kredsløb er så simpelt som at tilføje DNA. Af disse grunde har cellefri genekspression fundet forskellige anvendelser, fra biosensorer5,6 til hurtigt prototyper syntetiske genkredsløb7,8 til udvikling af kunstige celler9. De fleste cellefri genekspression anvender cellulære lysater, der er blevet stærkt behandlet, hvilket generelt kræver lange og komplekse protokoller, specialiseret udstyr og /eller følsomme trin, der kan føre til betydelig variation mellem brugere og batches10,11.
Dette papir beskriver en enkel og effektiv metode til fremstilling af cellefri lysat, der kræver minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er afhængig af E. coli celler, der er konstrueret til at lyse efter en simpel fryse-optø cyklus. Cellerne udtrykker en endolysin fra phage lambda, der nedbryder cellevæggen. Efterhånden som cellerne vokser, forbliver denne endolysin i cytoplasmaet, der er afsondret fra cellevæggen. Men en simpel fryse-optø cyklus forstyrrer cytoplasmisk membran, frigive endolysin i periferien, hvor det nedbryder cellevæggen, hvilket resulterer i hurtig celle lysis. Protokollen kan afsluttes med kun et par timers praktisk arbejde og kræver kun en fryser, en centrifuge, der er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheder kan bruges med mere omhu for ikke at forstyrre pellet), en vortex mixer og en simpel bufferløsning. Funktionelt lysat kan endda produceres ved frysetørring af cellerne og rehydrere dem in situ. Denne metode producerer dog lysater med lavere aktivitet, formodentlig på grund af de resterende cellerester.
Lysaterne er meget aktive for cellefri genekspression, og de kan forbedres på forskellige måder afhængigt af slutanvendelsen. Hastigheden af proteinsyntese kan øges yderligere ved at koncentrere lysatet ved hjælp af standard spin koncentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mod nedbrydning ved at tilsætte renset GamS-protein. Proteinforringelse, der er nødvendig for mere komplekse kredsløbsdynamikker såsom svingning, kan opnås ved at co-udtrykke en ClpX hexamer i den autolysatproducerende stamme13. Endelig aktiveres LacZ-baserede visuelle udlæsninger ved hjælp af en autolysatstamme, der mangler lacZ. Samlet set producerer denne metode meget aktiv cellefri lysat, der er egnet til en bred vifte af applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

Cellefri genekspression giver kraften i biologi uden komplikationer af en levende organisme. Selv om mange sådanne genekspressionssystemer findes, de fleste er ret dyre at købe og / eller kræver særligt udstyr og fint finpudset ekspertise til at producere effektivt. Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af bakteriecellefri lysat, der understøtter høje niveauer af genekspression, kun ved hjælp af standard laboratorieudstyr og kræver minimal behandling. Metoden bruger en Escherichia coli stamme producerer en endolysin, der ikke påvirker væksten, men som effektivt lyses en høstet celle pellet efter en simpel fryse-optø cyklus. Den eneste yderligere behandling, der kræves, er en kort inkubation efterfulgt af centrifugering for at rydde autolysatet af cellulære snavs. Dynamiske genkredsløb kan opnås gennem heterologt udtryk for ClpX protease i cellerne før høst. En E. coli stamme mangler lacZ genet kan bruges til høj følsomhed, cellefri biosensing applikationer ved hjælp af en colorimetric eller fluorescerende udlæsning. Hele protokollen kræver så få som 8-9 timer, med kun 1-2 timers praktisk arbejde fra podning til færdiggørelse. Ved at reducere omkostningerne og tiden til at opnå cellefri lysat, bør denne metode øge overkommeligheden af celle-fri genekspression for forskellige applikationer.

Repræsentative resultater kan observeres ved at bruge autolysat til at udtrykke GFP fra en konstituerende udtrykke plasmid, her pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, og registrering af et tidsforløb af GFP fluorescens i en pladelæser (Figur 1B). En fortyndingsserie af plasmid-DNA fandt stærkt udtryk selv ved 1 nM DNA. Sammenlignet med et kommercielt tilgængeligt lysat kan autolysat producere et større samlet udbytte og opnå en større maksimal produktionsrate, beregnet som tidsderivater f...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Denne protokol beskriver en hurtig og enkel metode til fremstilling af bakteriel lysat til cellefri genekspression ved hjælp af en konstrueret stamme af Escherichia coli og kræver kun standard laboratorieudstyr.

Hurtig, overkommelig og ukompliceret produktion af bakteriecellefri lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Ved hjælp af denne protokol kan bakteriecellelyater af høj kvalitet kun produceres ved hjælp af bredt tilgængelige fælles laboratorieudstyr, hvilket gør cellefri genekspression let tilgængelig for de fleste forskere. Ved at kombinere program cellulær autolyse med en fryse-optø eller fryse-tør cyklus giver mulighed for at skabe en praktisk, arbejdskraft og omkostningseffektiv tilgang til hurtig produktion af bakterielle lysater til celle-fri genekspression. Begynd med at bruge en podningsløkke til at stribe cellerne i en autolyse E.coli stamme på LB agar plader, der indeholder 50 mikrogram per milliliter ampicillin, derefter inkubere pladerne ved 37 grader Celsius natten over.Den følgende dag, ved hjælp af en pipette spids, vælge en enkelt koloni fra agar plade og tilføje det i en kultur rør, der indeholder LB medium med ampicillin. Dyrk denne starterkultur ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag, tilføje 400 mikroliter af starteren kultur i en en liter Erlenmeyer kolbe indeholdende 400 milliliter af 2xYTPG medium suppleret med 50 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius med rysten ved 300 RPM. Ved hjælp af et spektrofotometer og et optisk cuvette med en en centimeter stilængde måles regelmæssigt kulturens optiske tæthed ved 600 nanometer. Når den optiske tæthed overstiger en, skal du begynde at fortynde kulturen fem gange før målinger for at sikre, at målingerne forbliver inden for det lineære område af et typisk laboratoriespektrofotometer.Når den optiske tæthed af den femdobbelte fortyndede kultur når 0,3, fjernes kolben fra inkubatoren og fortsætter med at forberede lysatet. For at forberede lysatet skal cellerne høstes ved centrifugering ved 1.800 x g i 15 minutter ved stuetemperatur. Hæld supernatanten af, og fjern den resterende væske ved hjælp af en pipette.Tilsæt 45 milliliter kold S30A buffer til pellet og genbruge pellet ved vortexing. Derefter vejes et tomt 50 milliliter centrifugerør, før cellerne overføres til røret. Centrifugere cellerne igen og kassere supernatanten.Aspirere eventuelle resterende supernatant ved hjælp af en pipette. Afvej røret igen og træk vægten af det tomme rør fra den viste vægt for at opnå pelletens vægt. For hver milligram celle pellet, tilføje to mikroliter af kolde S30A buffer suppleret med to millimolar dithiothreitol.Derefter genbruges cellerne ved kraftig hvirvlen. Derefter fryse cellerne ved at placere dem i en negativ 20 eller negativ 80 grader Celsius fryser, indtil pellet er grundigt frosset, derefter optø cellerne i en stuetemperatur vandbad og hvirvle kraftigt i to til tre minutter. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 45 minutter med rysten ved 300 omdr./min. og fjern derefter prøven af tungt cellulært snavs ved centrifugering i gennemsigtige centrifugerør ved 30.000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius.Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt rør med en pipette, idet du passer på ikke at forstyrre pellet. Hvis det overførte supernatant er forurenet med materiale fra pelleten, gentages centrifugeringen. Overfør supernatanten til 1,5 milliliter centrifugerør.Og centrifuge igen ved 21,000 x g eller den maksimale hastighed af en bordplade centrifuge i fem minutter. Aliquot den ryddede autolysate i ønskede mængder og gemme på minus 80 grader Celsius indtil brug. For cellefri genekspression ved hjælp af autolysat blandes otte mikroliter autolysat og 8,9 mikroliter af forblanding på is.Tilføj DNA til en endelig koncentration af otte nanomol, alle andre nødvendige reagenser og vand for at opnå et endeligt volumen på 20 mikroliter. Tilføj reaktionen på en 384-brønd mikroplade og bruge en pladelæser til at måle fluorescens tidsforløb og slutpunkter. GFP-ekspression ved hjælp af autolysat med en fortyndingsserie af plasma-DNA resulterer i stærkt udtryk selv med et nanomolar DNA.Ved at sammenligne GFP-udtrykket mellem et kommercielt tilgængeligt lysat og autolysatet producerede autolysatet sammenlignelige niveauer af GFP. Variabilitet mellem partier af lysat produceret i to forskellige laboratorier af forskellige forskere var inden for omkring to gange. De tre mest kritiske variabler er celle pellet til buffer ratio, overførsel vragrester-fri supernatant og ved hjælp af optimal PEG og magnesium koncentration i den endelige reaktion.Når ekstraktet er udarbejdet, kan et stort arsenal af eksisterende protokoller udviklet til E.coli celle-fri udtryk systemer anvendes, såsom ClpXP-medieret nedbrydning, eller AHL-medieret kvorum sensing.

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Analysering proteasomalaktivitet Nedbrydning i en celle-fri system i planter

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

Opførelse af en overkommelig og nem at Build Zebrafisk Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid DNA Extraction Metode til kvalitativ og kvantitativ vurdering af bakteriel Fællesskabers fra fjerkræproduktion Prøver

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualisering og Kvantificering af Cell-fri Layer i arterioler af rotte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Produktion og visualisering af bakterielle Spheroplasts og Protoplasts til at karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Sædopsamling og computerassisteret sædanalyse i Teleost-modellen japansk Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Populations- og enkeltcelleanalyse af antibiotikapersistens i Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

Metoder til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogeler i makroskala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...