Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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Les auteurs remercient Zachary Sun et Richard Murray (California Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni le plasmide P_araBAD-gamS, et Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni une centrifugeuse de refroidissement à grande vitesse. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du programme ARO MURI et a été en partie soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japon.

1. Préparez les supports et les tampons.
<ol><li>Préparez 2xYTPG medium.<ol>
<li>Mélanger 62 g de poudre 2xYT, 5,99 g de phosphate de potassium monobasique, 13,93 g de phosphate de potassium dibasique et de l’eau désionisée à 2 L.</li>
		<li>Autoclave sur cycle liquide avec un temps d’exposition de 30 min14.</li>
		<li>À 400 mL de milieu 2xYTP du 1.1.2, ajouter 7,2 g de D-glucose (dextrose) et mélanger jusqu’à dissolution.</li>
		<li>Filtrer-stériliser à travers un filtre de 0,2...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. 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Le protocole décrit ici produit un lysat bactérien hautement actif pour l’expression de gènes sans cellules. La clé est d’utiliser des cellules porteuses du plasmide pAD-LyseR, qui exprime l’endolysine du phage lambda de manière cytosolique. Ces cellules sont potentialisées pour se lyser lors de la perméabilisation de la membrane interne, permettant à l’endolysine d’accéder à la paroi cellulaire, ce que la méthode réalise grâce à un simple cycle de gel-dégel. Parce que les cellules se lysent effi...

L’expression génique dans les lysats sans cellules présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de cellules vivantes1,2,3,4. Les lysats peuvent être facilement modifiés biochimiquement et utilisés dans des conditions qui pourraient être préjudiciables ou impossibles à atteindre dans les cellules vivantes. Les circuits d’expression génique n’ont pas à rivaliser ou à rivaliser avec les processus biologiques de l’hôte, et tester de nouveaux circuits génétiques est aussi simple que d’ajouter de l’ADN. Pour ces raisons, l’expression génique sans cellules a trouvé diverses applications, des biocapteurs5,6 au prototypage rapide de circuits de gènes synthétiques7,8 au développement de cellules artificielles9. La plupart des expressions géniques sans cellules utilisent des lysats cellulaires qui ont été hautement transformés, nécessitant généralement des protocoles longs et complexes, un équipement spécialisé et / ou des étapes sensibles pouvant entraîner des variations significatives entre les utilisateurs et les lots10,11.
Cet article décrit une méthode simple et efficace de production de lysat sans cellule qui nécessite un traitement et une expertise minimes (Figure 1A)12. La méthode repose sur des cellules d’E. coli qui sont conçues pour lyser après un simple cycle de gel-dégel. Les cellules expriment une endolysine du phage lambda qui dégrade la paroi cellulaire. Au fur et à mesure que les cellules se développent, cette endolysine reste dans le cytoplasme, séquestrée de la paroi cellulaire. Cependant, un simple cycle de gel-dégel perturbe la membrane cytoplasmique, libérant l’endolysine dans le périplasme, où elle dégrade la paroi cellulaire, entraînant une lyse cellulaire rapide. Le protocole peut être complété avec seulement quelques heures de travail pratique et ne nécessite qu’un congélateur, une centrifugeuse capable de 30 000 × g (pour des résultats optimaux; des vitesses plus faibles peuvent être utilisées avec plus de soin pour ne pas déranger le granulé), un mélangeur vortex et une solution tampon simple. Le lysat fonctionnel peut même être produit en lyophilisant les cellules et en les réhydratant in situ. Cependant, cette méthode produit des lysats avec une activité plus faible, probablement en raison des débris cellulaires restants.
Les lysats sont très actifs pour l’expression de gènes sans cellules, et ils peuvent être améliorés de différentes manières en fonction de l’utilisation finale. Le taux de synthèse des protéines peut être encore augmenté en concentrant le lysat à l’aide de concentrateurs de spin standard. L’ADN linéaire peut être protégé de la dégradation en ajoutant de la protéine GamS purifiée. La dégradation des protéines, nécessaire à une dynamique de circuit plus complexe telle que l’oscillation, peut être obtenue en co-exprimant un hexamère ClpX dans la souche13productrice d’autolysats. Enfin, les lectures visuelles basées sur LacZ sont activées en utilisant une souche autolysée dépourvue de lacZ. Dans l’ensemble, cette méthode produit un lysat sans cellules hautement actif qui convient à un large éventail d’applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

L’expression génique sans cellules offre le pouvoir de la biologie sans les complications d’un organisme vivant. Bien qu’il existe de nombreux systèmes d’expression génique de ce type, la plupart sont assez coûteux à l’achat et / ou nécessitent un équipement spécial et une expertise finement affinée pour produire efficacement. Ce protocole décrit une méthode de production de lysat sans cellules bactériennes qui soutient des niveaux élevés d’expression génique, en utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire standard et nécessitant un traitement minimal. La méthode utilise une souche d’Escherichia coli produisant une endolysine qui n’affecte pas la croissance, mais qui lyse efficacement une pastille cellulaire récoltée après un simple cycle de gel-dégel. Le seul traitement supplémentaire requis est une brève incubation suivie d’une centrifugation pour éliminer l’autolysat des débris cellulaires. Des circuits géniques dynamiques peuvent être obtenus grâce à l’expression hétérologue de la protéase ClpX dans les cellules avant le prélèvement. Une souche d’E. coli dépourvue du gène lacZ peut être utilisée pour des applications de biodétection haute sensibilité et sans cellules à l’aide d’une lecture colorimétrique ou fluorescente. L’ensemble du protocole nécessite aussi peu que 8-9 heures, avec seulement 1-2 heures de travail pratique de l’inoculation à l’achèvement. En réduisant le coût et le temps d’obtention du lysat sans cellule, cette méthode devrait augmenter l’abordabilité de l’expression génique sans cellule pour diverses applications.

Des résultats représentatifs peuvent être observés en utilisant l’autolysat pour exprimer la GFP à partir d’un plasmide exprimant de manière constitutive, ici pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, et en enregistrant un cours temporel de fluorescence GFP dans un lecteur de plaques(Figure 1B). Une série de dilution d’ADN plasmidique a trouvé une forte expression même à 1 nM d’ADN. Par rapport à un lysat disponible dans le commerce, l’autolysat peut produire un rendement total ...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.

Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

En utilisant ce protocole, des lysats de cellules bactériennes de haute qualité peuvent être produits en utilisant uniquement des équipements de laboratoire courants largement disponibles, ce qui rend l’expression génique sans cellules facilement accessible à la plupart des chercheurs. La combinaison de l’autolyse cellulaire programmée avec un cycle lyophilisation-décongélation ou lyophilisation permet de créer une approche pratique, laborieuse et rentable pour la production rapide de lysats bactériens pour l’expression génique sans cellule. Commencez par utiliser une boucle d’inoculation pour strier les cellules d’une souche d’E. coli d’autolyse sur des plaques de gélose LB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, à l’aide d’une pointe de pipette, choisissez une seule colonie dans la plaque de gélose et ajoutez-la dans un tube de culture contenant un milieu LB avec de l’ampicilline. Cultivez cette culture de démarrage à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 400 microlitres de la culture de démarrage dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre contenant 400 millilitres de milieu 2xYTPG complété par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 300 tr / min. À l’aide d’un spectrophotomètre et d’une cuvette optique d’une longueur de trajet d’un centimètre, mesurez périodiquement la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Lorsque la densité optique dépasse un, commencez à diluer la culture cinq fois avant les mesures pour vous assurer que les mesures restent dans la plage linéaire d’un spectrophotomètre de laboratoire typique.Une fois que la densité optique de la culture quintuple diluée atteint 0,3, retirez la fiole de l’incubateur et procédez à la préparation du lysat. Pour préparer le lysat, prélèvez les cellules par centrifugation à 1 800 x g pendant 15 minutes à température ambiante. Versez le surnageant et retirez le liquide restant à l’aide d’une pipette.Ajouter 45 millilitres de tampon S30A froid à la pastille et remettre la pastille en suspension par vortex. Ensuite, pesez un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres avant de transférer les cellules dans le tube. Centrifugez à nouveau les cellules et jetez le surnageant.Aspirer tout surnageant restant à l’aide d’une pipette. Pesez à nouveau le tube et soustrayez le poids du tube vide du poids affiché pour obtenir le poids de la pastille. Pour chaque milligramme de pastille cellulaire, ajoutez deux microlitres de tampon S30A froid complété par deux millimolaires de dithiothréitol.Ensuite, ressuspendez les cellules par un vortex vigoureux. Ensuite, congelez les cellules en les plaçant dans un congélateur négatif de 20 ou 80 degrés Celsius jusqu’à ce que la pastille soit complètement congelée, puis décongelez les cellules dans un bain-marie à température ambiante et un vortex vigoureusement pendant deux à trois minutes. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes en agitant à 300 tr / min, puis nettoyer l’échantillon de débris cellulaires lourds en centrifugant dans des tubes centrifuges transparents à 30 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.Transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Si le surnageant transféré est contaminé par un matériau provenant de la pastille, répétez la centrifugation. Transférer le surnageant dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre.Et centrifugez une fois de plus à 21 000 x g ou la vitesse maximale d’une centrifugeuse de table pendant cinq minutes. Aliquotez l’autolysat dégagé dans les volumes souhaités et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour l’expression génique sans cellules à l’aide de l’autolysat, mélanger huit microlitres d’autolysat et 8,9 microlitres de prémélange sur glace.Ajouter de l’ADN à une concentration finale de huit nanomoles, tout autre réactif nécessaire et de l’eau pour obtenir un volume final de 20 microlitres. Ajoutez la réaction à une microplaque de 384 puits et utilisez un lecteur de plaque pour mesurer le cours du temps de fluorescence et les extrémités. L’expression de GFP à l’aide de l’autolysat avec une série de dilution d’ADN plasmatique donne une expression forte même avec un ADN nanomolaire.En comparant l’expression de GFP entre un lysat disponible dans le commerce et l’autolysat, l’autolysat a produit des niveaux comparables de GFP. La variabilité entre les lots de lysat produits dans deux laboratoires différents par des chercheurs différents était d’environ deux fois. Les trois variables les plus critiques sont le rapport granulé cellulaire/tampon, le transfert d’un surnageant sans débris et l’utilisation d’une concentration optimale de PEG et de magnésium dans la réaction finale.Une fois l’extrait préparé, un large arsenal de protocoles existants développés pour les systèmes d’expression sans cellules E. coli peut être utilisé, tels que la dégradation médiée par ClpXP ou la détection du quorum médiée par AHL.

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