Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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Die Autoren danken Zachary Sun und Richard Murray (California Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung des Plasmids P_araBAD-gamS und Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung einer Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und des ARO MURI-Programms unterstützt und teilweise von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan, unterstützt.

1. Bereiten Sie Medien und Puffer vor.
<ol><li>Bereiten Sie 2xYTPG Medium vor.<ol>
<li>Mischen Sie 62 g 2xYT Pulver, 5,99 g Kaliumphosphat monobasisch, 13,93 g Kaliumphosphat zweibasisch und entionisiertes Wasser zu 2 L.</li>
		<li>Autoklav auf Flüssigkeitszyklus mit einer Einwirkzeit von 30 min14.</li>
		<li>Auf 400 ml 2xYTP-Medien aus 1.1.2 werden 7,2 g D-Glucose (Dextrose) zugegeben und bis zur Auflösung gemischt.</li>
		<li>Filter-Sterilisieren Durch einen 0,2 μm Filter.</li>
	</ol>
</li>...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. 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Das hier beschriebene Protokoll liefert hochaktives bakterielles Lysat für die zellfreie Genexpression. Der Schlüssel liegt darin, Zellen zu verwenden, die das Plasmid pAD-LyseR tragen, das den Lambda-Phagen Endolysin zytosolisch exprimiert. Diese Zellen werden potenziert, um sich bei der Permeabilisierung der inneren Membran selbst zu lysieren, so dass das Endolysin Zugang zur Zellwand erhält, was die Methode durch einen einfachen Gefrier-Tau-Zyklus erreicht. Da sich die Zellen effektiv selbst lysieren, wird das Prod...

Die Genexpression in zellfreien Lysaten hat mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung lebender Zellen1,2,3,4. Lysate können leicht biochemisch modifiziert und unter Bedingungen verwendet werden, die für lebende Zellen schädlich oder unmöglich zu erreichen sein könnten. Genexpressionsschaltkreise müssen nicht mit biologischen Prozessen des Wirts konkurrieren oder konkurrieren, und das Testen neuer genetischer Schaltkreise ist so einfach wie das Hinzufügen von DNA. Aus diesen Gründen hat die zellfreie Genexpression verschiedene Anwendungen gefunden, von den Biosensoren5,6 über das schnelle Prototyping synthetischer Genschaltkreise7,8 bis hin zur Entwicklung künstlicher Zellen9. Die meisten zellfreien Genexpressionen verwenden zelluläre Lysate, die hochgradig verarbeitet wurden und im Allgemeinen lange und komplexe Protokolle, spezielle Ausrüstung und / oder empfindliche Schritte erfordern, die zu erheblichen Abweichungen zwischen Benutzern und Chargen führen können10,11.
Dieses Papier beschreibt eine einfache, effiziente Methode zur Herstellung von zellfreiem Lysat, die minimale Verarbeitung und Expertise erfordert (Abbildung 1A)12. Die Methode basiert auf E. coli-Zellen, die so konstruiert sind, dass sie nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus lysieren. Die Zellen exprimieren ein Endolysin aus Phagen-Lambda, das die Zellwand abbaut. Während die Zellen wachsen, verbleibt dieses Endolysin im Zytoplasma, abgetrennt von der Zellwand. Ein einfacher Gefrier-Tau-Zyklus stört jedoch die zytoplasmatische Membran und setzt das Endolysin in das Periplasma frei, wo es die Zellwand abbaut, was zu einer schnellen Zelllyse führt. Das Protokoll kann mit nur wenigen Stunden praktischer Arbeit abgeschlossen werden und erfordert nur einen Gefrierschrank, eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 × g (für optimale Ergebnisse; niedrigere Geschwindigkeiten können mit mehr Sorgfalt verwendet werden, um das Pellet nicht zu stören), einen Wirbelmischer und eine einfache Pufferlösung. Funktionelles Lysat kann sogar hergestellt werden, indem die Zellen gefriergetrocknet und in siturehydriert werden. Diese Methode produziert jedoch Lysate mit geringerer Aktivität, vermutlich aufgrund der verbleibenden Zelltrümmer.
Die Lysate sind hochaktiv für die zellfreie Genexpression und können je nach Endverwendung auf verschiedene Weise verbessert werden. Die Geschwindigkeit der Proteinsynthese kann weiter erhöht werden, indem das Lysat unter Verwendung von Standard-Spinkonzentratoren konzentriert wird. Lineare DNA kann durch Zugabe von gereinigtem GamS-Protein vor dem Abbau geschützt werden. Der Proteinabbau, der für komplexere Schaltkreisdynamiken wie Oszillation notwendig ist, kann durch Co-Exprimation eines ClpX-Hexamers im autolysatproduzierenden Stamm13erreicht werden. Schließlich werden LacZ-basierte visuelle Auslesungen ermöglicht, indem ein Autolysat-Stamm ohne lacZverwendet wird. Insgesamt erzeugt dieses Verfahren ein hochaktives zellfreies Lysat, das sich für ein breites Anwendungsspektrum eignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

Die zellfreie Genexpression bietet die Kraft der Biologie ohne die Komplikationen eines lebenden Organismus. Obwohl es viele solcher Genexpressionssysteme gibt, sind die meisten ziemlich teuer in der Anschaffung und / oder erfordern spezielle Ausrüstung und fein geschliffenes Fachwissen, um effektiv zu produzieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat, das ein hohes Maß an Genexpression unterstützt, nur Standardlaborgeräte verwendet und nur minimale Verarbeitung erfordert. Die Methode verwendet einen Escherichia coli-Stamm, der ein Endolysin produziert, das das Wachstum nicht beeinflusst, aber ein geerntetes Zellpellet nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus effizient lysiert. Die einzige weitere Verarbeitung, die erforderlich ist, ist eine kurze Inkubation, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Autolysat von Zelltrümmern zu befreien. Dynamische Genschaltkreise können durch heterologe Expression der ClpX-Protease in den Zellen vor der Ernte erreicht werden. Ein E. coli-Stamm, dem das lacZ-Gen fehlt, kann für hochempfindliche, zellfreie Biosensoranwendungen unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluoreszierenden Anzeige verwendet werden. Das gesamte Protokoll erfordert nur 8-9 Stunden, mit nur 1-2 Stunden praktischer Arbeit von der Impfung bis zur Fertigstellung. Durch die Reduzierung der Kosten und des Zeitaufwands für die Gewinnung von zellfreiem Lysat soll diese Methode die Erschwinglichkeit der zellfreien Genexpression für verschiedene Anwendungen erhöhen.

Repräsentative Ergebnisse können beobachtet werden, indem man mit Autolysat GFP aus einem konstitutiv exprimierenden Plasmid, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, exprimiert und einen Zeitverlauf der GFP-Fluoreszenz in einem Plattenleser aufzeichnet (Abbildung 1B). Eine Verdünnungsserie von Plasmid-DNA fand selbst bei 1 nM-DNA eine starke Expression. Im Vergleich zu einem handelsüblichen Lysat kann das Autolysat eine größere Gesamtausbeute erzeugen und eine größere maximale Produkt...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Mit diesem Protokoll können hochwertige bakterielle Zelllysate nur mit allgemein verfügbaren Laborgeräten hergestellt werden, so dass die zellfreie Genexpression für die meisten Forscher leicht zugänglich ist. Die Kombination der zellulären Autolyse des Programms mit einem Gefrier-Tau- oder Gefrier-Trocken-Zyklus ermöglicht die Schaffung eines praktischen, arbeits- und kostengünstigen Ansatzes für die schnelle Produktion von Bakteriellen Lysaten für die zellfreie Genexpression. Beginnen Sie mit einer Impfschleife, um die Zellen eines Autolyse-E. coli-Stammes auf LB-Agarplatten mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin zu streifen, und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag wird mit einer Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte entnommen und in ein Kulturröhrchen gegeben, das LB-Medium mit Ampicillin enthält. Bauen Sie diese Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius an. Am nächsten Tag werden 400 Mikroliter der Starterkultur in einen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 400 Milliliter 2xYTPG-Medium enthält, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 U / min. Messen Sie mit einem Spektralphotometer und einer optischen Küvette mit einer Weglänge von einem Zentimeter regelmäßig die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn die optische Dichte eins überschreitet, beginnen Sie vor den Messungen mit der fünffachen Verdünnung der Kultur, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich eines typischen Laborspektrophotometers bleiben.Sobald die optische Dichte der fünffach verdünnten Kultur 0,3 erreicht hat, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie mit der Vorbereitung des Lysat fort. Um das Lysat vorzubereiten, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.800 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand ab und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette.Fügen Sie dem Pellet 45 Milliliter kalten S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Wirbeln. Wiegen Sie dann ein leeres 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, bevor Sie die Zellen in das Röhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand.Aspirieren Sie den verbleibenden Überstand mit einer Pipette. Wiegen Sie das Rohr erneut und subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Rohres von dem angezeigten Gewicht, um das Gewicht des Pellets zu erhalten. Für jedes Milligramm Zellpellet fügen Sie zwei Mikroliter kalten S30A-Puffer hinzu, der mit zwei Millimolar-Dithiothreitol ergänzt wird.Dann resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Wirbeln. Als nächstes frieren Sie die Zellen ein, indem Sie sie in einen minus 20 oder minus 80 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank legen, bis das Pellet gründlich eingefroren ist, dann die Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auftauen und zwei bis drei Minuten lang kräftig wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten mit Schütteln bei 300 U / min und reinigen Sie dann die Probe von schweren Zelltrümmern, indem Sie sie in transparenten Zentrifugenröhrchen bei 30.000 x g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues Röhrchen überführen, wobei darauf zu achten ist, das Pellet nicht zu stören. Wenn der übertragene Überstand mit Material aus dem Pellet kontaminiert ist, wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen überführen.Und noch einmal mit 21.000 x g oder der maximalen Geschwindigkeit einer Tischzentrifuge für fünf Minuten zentrifugieren. Aliquot das gereinigte Autolysat in gewünschte Mengen und lagern bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Für die zellfreie Genexpression mit dem Autolysat mischen Sie acht Mikroliter Autolysat und 8,9 Mikroliter Pre-Mix auf Eis.Fügen Sie DNA zu einer Endkonzentration von acht Nanomol, andere notwendige Reagenzien und Wasser hinzu, um ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern zu erhalten. Fügen Sie die Reaktion zu einer 384-Well-Mikroplatte hinzu und verwenden Sie einen Plattenleser, um den Fluoreszenzzeitverlauf und die Endpunkte zu messen. Die GFP-Expression unter Verwendung des Autolysats mit einer Verdünnungsreihe von Plasma-DNA führt zu einer starken Expression selbst bei einer nanomolaren DNA.Beim Vergleich der GFP-Expression zwischen einem kommerziell erhältlichen Lysat und dem Autolysat ergab das Autolysat vergleichbare GFP-Werte. Die Variabilität zwischen Lysatchargen, die in zwei verschiedenen Labors von verschiedenen Forschern hergestellt wurden, betrug etwa das Doppelte. Die drei kritischsten Variablen sind das Verhältnis von Zellpellets zu Puffer, die Übertragung von schmutzfreiem Überstand und die Verwendung einer optimalen PEG- und Magnesiumkonzentration in der endgültigen Reaktion.Sobald der Extrakt vorbereitet ist, kann ein großes Arsenal bestehender Protokolle verwendet werden, die für zellfreie E.coli-Expressionssysteme entwickelt wurden, wie z. B. ClpXP-vermittelte Degradation oder AHL-vermittelte Quorum-Sensing.

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