Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

המחברים מודים לזאקרי סאן וריצ'רד מוריי (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) על שסיפקו בחביבות את הפלסמיד P_araBAD-gamS, ואת Kaeko Kamei (המכון הטכנולוגי של קיוטו) על שסיפקו בחביבות צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ומתוכנית ARO MURI ונתמכה בחלקה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצוינים, MEXT, יפן.

1. הכן מדיה ומאגרים.
<ol><li>הכן 2xYTPG בינוני.<ol>
<li>יש לערבב 62 גרם אבקת 2xYT, 5.99 גרם אשלגן פוספט מונובאזי, 13.93 גרם אשלגן פוספט דיבסי ומים דה-יוניים ל-2 ליטר.</li>
		<li>Autoclave על מחזור נוזלי עם זמן חשיפה של 30 דקות14.</li>
		<li>ל-400 מ"ל של מדיה של 2xYTP מ-1.1.2, הוסיפו 7.2 גרם D-גלוקוז (דקסטרוז) וערבבו עד להמסה.</li>...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מניב ליסאט חיידקי פעיל מאוד לביטוי גנים ללא תאים. המפתח הוא להשתמש בתאים הנושאים את pAD-LyseR, המבטא את הלמבדה פאג' אנדוליסין בציטוזוליה. תאים אלה הם potentiated כדי lyse עצמם על permeabilization של הממברנה הפנימית, המאפשר את הגישה אנדוליסין לקיר התא, אשר השיטה משיגה באמצעות מחזור פשוט לה?...

ביטוי גנים בליסאטים ללא תאים יש מספר יתרונות על פני שימוש בתאים חיים1,2,3,4. ליסאטים ניתן לשנות בקלות ביוכימית ולהשתמש בתנאים שיכולים להיות מזיקים או בלתי אפשרי להשיג בתאים חיים. מעגלי ביטוי גנים אינם צריכים להתמודד או להתחרות בתהליכים ביולוגיים מארחים, ובדיקת מעגלים גנטיים חדשים היא פשוטה כמו הוספת DNA. מסיבות אלה, ביטוי גנים ללא תאים מצא יישומים שונים, מ biosensors5,6 כדי במהירות טיפוס מעגלי גנים סינתטיים7,8 לפתח תאים מלאכותיים9. רוב ביטוי הגנים ללא תאים משתמש lysates הסלולר כי כבר מעובד מאוד, בדרך כלל דורש פרוטוקולים ארוכים ומורכבים, ציוד מיוחד, ו / או צעדים רגישים שיכולים להוביל וריאציה משמעותית בין משתמשים אצוות10,11.
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לייצור ליסאט ללא תאים הדורש עיבוד ומומחיות מינימליים (איור 1A)12. השיטה מסתמכת על תאי E. coli כי הם מהונדסים lyse לאחר מחזור פשוט להפשיר הקפאה. התאים מבטאים אנדוליסין מפג' למדה שמשפיל את דופן התא. ככל שהתאים גדלים, אנדוליסין זה נשאר בציטופלסמה, מופרד מקיר התא. עם זאת, מחזור פשוט להפשרת הקפאה משבש את הממברנה הציטופלסמית, משחרר את האנדוליזין לתוך הפריפלסמה, שם הוא משפיל את דופן התא, וכתוצאה מכך תמוגה מהירה של התא. הפרוטוקול יכול להסתיים עם רק כמה שעות של עבודה מעשית ודורש רק מקפיא, צנטריפוגה המסוגלת 30,000 × גרם (לקבלת תוצאות אופטימליות; מהירויות נמוכות יותר ניתן להשתמש בזהירות רבה יותר לא להפריע לכדור), מערבל מערבולת, ופתרון חיץ פשוט. ליסאט פונקציונלי יכול אפילו להיות מיוצר על ידי ייבוש קפוא של התאים rehydrating אותם במקום. עם זאת, שיטה זו מייצרת lysates עם פעילות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל פסולת התא הנותרת.
lysates פעילים מאוד עבור ביטוי גנים ללא תאים, והם יכולים להיות משופרים בדרכים שונות בהתאם לשימוש הסופי. ניתן להגדיל עוד יותר את קצב סינתזת החלבון על ידי ריכוז ה- lysate באמצעות רכזי ספין סטנדרטיים. ניתן להגן על דנ"א ליניארי מפני השפלה על ידי הוספת חלבון GamS מטוהר. השפלת חלבונים, הכרחית לדינמיקת מעגלים מורכבת יותר כגון תנודה, ניתן להשיג על ידי הבעת הקסאמר ClpX בזן13המייצר באופן אוטומטי . לבסוף, קריאות חזותיות מבוססות LacZ מופעלות באמצעות זן autolysate חסר lacZ. בסך הכל, שיטה זו מייצרת ליסאט פעיל מאוד ללא תאים המתאים למגוון רחב של יישומים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

ביטוי גנים ללא תאים מציע את כוחה של הביולוגיה ללא סיבוכים של אורגניזם חי. למרות שקיימות מערכות ביטוי גנים רבות כאלה, רובן יקרות למדי לקנייה ו/או לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות מושחזת דק כדי לייצר ביעילות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור ליסאט נטול תאים חיידקי התומך ברמות גבוהות של ביטוי גנים, תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד ודורש עיבוד מינימלי. השיטה משתמשת בזן קולי Escherichia המייצר אנדוליסין שאינו משפיע על הצמיחה, אך מייצר ביעילות גלולה של תאים שנקטפו לאחר מחזור פשוט של הפשרת הקפאה. העיבוד הנוסף היחיד הנדרש הוא דגירה קצרה ואחריה צנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת הסלולר. מעגלי גנים דינמיים יכולים להיות מושגים באמצעות ביטוי הטרולוגי של פרוטאז ClpX בתאים לפני הקציר. זן E. coli חסר הגן lacZ יכול לשמש עבור רגישות גבוהה, יישומי biosensing ללא תאים באמצעות קריאה צבעונית או פלואורסצנטית. הפרוטוקול כולו דורש מעט כמו 8-9 שעות, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית מחיסון להשלמה. על ידי הפחתת העלות והזמן כדי לקבל lysate ללא תאים, שיטה זו צריכה להגדיל את המחיר הזול של ביטוי גנים ללא תאים עבור יישומים שונים.

ניתן לראות תוצאות מייצגות באמצעות autolysate כדי לבטא GFP מתוך פלסמיד מבטא באופן מרכיב, כאן pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, והקלטת קורס זמן של פלואורסצנטיות GFP בקורא לוחות(איור 1B). סדרת דילול של דנ"א פלסמיד מצאה ביטוי חזק אפילו בדנ"א של 1 ננומטר. בהשוואה ליסאט זמין מסחרית, autolysate יכול לייצר תשואה ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר ליסאטים תאי חיידקיים באיכות גבוהה באמצעות ציוד מעבדה משותף זמין רק באופן נרחב, מה שהופך ביטוי גנים ללא תאים נגיש בקלות לרוב החוקרים. שילוב של אוטוליזה תאית של תוכנית עם מחזור הפשרה או ייבוש בהקפאה מאפשר ליצור גישה מעשית, עבודה וחסכונית לייצור מהיר של ליסאטים חיידקיים לביטוי גנים ללא תאים. התחל על ידי שימוש בלולאת חיסון כדי פס התאים של זן E.coli autolysis על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ולאחר מכן לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה.למחרת, באמצעות קצה פיפטה, לבחור מושבה אחת מצלחת אגר ולהוסיף אותו לתוך צינור תרבות המכיל LB בינוני עם אמפיצלין. לגדל את תרבות המתנע הזה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להוסיף 400 microliters של התרבות המתנע לתוך בקבוקון Erlenmeyer ליטר אחד המכיל 400 מיליליטר של 2xYTPG בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפצילין.לדגור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 300 סל"ד. באמצעות ספקטרופוטומטר וקובט אופטי עם אורך נתיב של סנטימטר אחד, מודדים מעת לעת את הצפיפות האופטית של התרבות ב-600 ננומטר. כאשר הצפיפות האופטית עולה על אחת, התחל לדלל את התרבות פי חמישה לפני המדידות כדי להבטיח שהמדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי.ברגע שהצפיפות האופטית של התרבות מדוללת פי חמישה מגיעה ל-0.3, הסירו את הבקבוק מהחממה והמשיכו להכין את הלסאט. כדי להכין את lysate, לקצור את התאים על ידי centrifugation ב 1, 800 x g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את supernatant ולהסיר את הנוזל הנותר באמצעות pipette.מוסיפים 45 מיליליטר של חוצץ S30A קר לכדור ו resuspend הכדור על ידי מערבולת. לאחר מכן, לשקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מיליליטר לפני העברת התאים לתוך הצינור. צנטריפוגה התאים שוב ולהשליך את supernatant.שאפו כל סופר-טבעי שנותר באמצעות פיפטה. שקול את הצינור שוב ולהפחית את המשקל של הצינור הריק מן המשקל המוצג כדי לקבל את המשקל של הכדור. על כל מיליגרם אחד של גלולה תא, להוסיף שני microliters של חוצץ S30A קר בתוספת שני מילימולרים dithiothreitol.לאחר מכן, תקיף מחדש את התאים על ידי מערבולת נמרצת. לאחר מכן, להקפיא את התאים על ידי הצבתם מינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא עד הכדור קפוא ביסודיות, ולאחר מכן להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר מערבולת במרץ במשך שתיים עד שלוש דקות. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד, ולאחר מכן לנקות את המדגם של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם pipette, דואג לא להפריע את הכדור. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על צנטריפוגה. מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר.וצנטריפוגה פעם נוספת ב 21, 000 x g או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן במשך חמש דקות. Aliquot autolysate אוטומטי לתוך כרכים הרצויים ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש. לביטוי גנים ללא תאים באמצעות autolysate, לערבב שמונה microliters של autolysate ו 8.9 microliters של מראש לערבב על קרח.הוסף DNA לריכוז סופי של שמונה ננומולים, כל ריאגנטים ומים נחוצים אחרים כדי להשיג נפח סופי של 20 מיקרוליטרים. הוסף את התגובה למיקרו-לוחית בעלת 384 באר והשתמש בקורא לוחות כדי למדוד את מסלול הזמן והנקודות הקצה של הפלואורסצנטיות. ביטוי GFP באמצעות autolysate עם סדרת דילול של DNA פלזמה תוצאות ביטוי חזק אפילו עם DNA ננומולרי אחד.בעת השוואת ביטוי GFP בין ליסייט זמין מסחרית ואת autolysate, autolysate המיוצר רמות דומות של GFP. השונות בין קבוצות של ליסאט המיוצר בשתי מעבדות שונות על ידי חוקרים שונים היה בתוך בערך פי שניים. שלושת המשתנים הקריטיים ביותר הם יחס גלולה עד חיץ של תאים, העברת סופר-נט ללא פסולת ושימוש בריכוז PEG ומגנזיום אופטימלי בתגובה הסופית.לאחר שהתמצית הוכנה, ניתן להשתמש בארסנל גדול של פרוטוקולים קיימים שפותחו עבור מערכות ביטוי חופש תא E.coli, כגון השפלה בתיווך ClpXP, או חישת מניין בתיווך AHL.

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

הקמת מתקן דג הזברה בנייה קלה למשתלם ו

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...