Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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लेखकों जचारी सूर्य और रिचर्ड मरे (कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया प्लाज्मिड P_araBAD-gams प्रदान करने के लिए धंयवाद, और Kaeko Kamei (क्योटो प्रौद्योगिकी संस्थान) कृपया एक उच्च गति ठंडा अपकेंद्रित्र प्रदान करने के लिए । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों और एआरओ मुरी कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और आंशिक रूप से उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं, MEXT, जापान के लिए अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था।

1. मीडिया और बफ़र्स तैयार करें।
<ol><li>2xYTPG माध्यम तैयार करें।<ol>
<li>62 ग्राम 2xYT पाउडर, 5.99 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 13.93 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट डिबेसिक, और 2 एल करने के लिए deionized पानी मिलाएं।</li>
		<li>30 मिनट14</s...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय बैक्टीरियल lysate पैदा करता है। कुंजी प्लाज्मिड पीएड-LyseR को ले जाने वाली कोशिकाओं का उपयोग करना है, जो लैम्ब्डा फेज एंडोलिसिन साइटोसोल?...

कोशिका मुक्त लिसेट में जीन अभिव्यक्ति के जीवित कोशिकाओं का उपयोग करने के कई फायदे हैं1,2,3,4. लिसेट को आसानी से जैव रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और उन स्थितियों में उपयोग किया जा सकता है जो जीवित कोशिकाओं में प्राप्त करने के लिए हानिकारक या असंभव हो सकती हैं। जीन अभिव्यक्ति सर्किट के लिए संघर्ष या मेजबान जैविक प्रक्रियाओं के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं है, और नए आनुवंशिक सर्किट का परीक्षण डीएनए जोड़ने के रूप में के रूप में सरल है । इन कारणों से, सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति में बायोसेंसर5, 6से लेकर सिंथेटिक जीन सर्किट7,8 को कृत्रिम कोशिकाओं को विकसित करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोग मिलेहैं। अधिकांश सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति सेलुलर lysates का उपयोग करती है जिन्हें अत्यधिक संसाधित किया गया है, आम तौर पर लंबे और जटिल प्रोटोकॉल, विशेष उपकरण, और/या संवेदनशील कदमों की आवश्यकता होती है जो उपयोगकर्ताओं और बैचों10, 11के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता पैदा कर सकते हैं ।
यह पत्र सेल-फ्री lysate के उत्पादन के लिए एक सरल, कुशल विधि का वर्णन करता है जिसके लिए न्यूनतम प्रसंस्करण और विशेषज्ञता(चित्रा 1A)12की आवश्यकता होती है। विधि ई. कोलाई कोशिकाओं पर निर्भर करती है जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद lyse करने के लिए इंजीनियर हैं। कोशिकाएं फेज लैम्ब्डा से एक एंडोलिसिन व्यक्त करती हैं जो कोशिका की दीवार को नीचा दिखाती है। जैसे-जैसे कोशिकाएं बढ़ रही हैं, यह एंडोलिसिन साइटोप्लाज्म में रहता है, जो सेल की दीवार से तनहा होता है। हालांकि, एक साधारण फ्रीज-गल चक्र साइटोप्लाज्मिक झिल्ली को बाधित करता है, एंडोलिसिन को पेरिप्लाज्म में जारी करता है, जहां यह कोशिका की दीवार को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप तेजी से सेल लाइसिस होता है। प्रोटोकॉल को केवल कुछ घंटों के काम के साथ पूरा किया जा सकता है और केवल एक फ्रीजर, 30,000 × जी में सक्षम एक अपकेंद्रित्र (इष्टतम परिणामों के लिए; कम गति का उपयोग अधिक देखभाल के साथ किया जा सकता है गोली को परेशान न करने के लिए), एक भंवर मिक्सर, और एक सरल बफर समाधान। कार्यात्मक रूप से भी कोशिकाओं को फ्रीज-सुखाने और उन्हें सीटू मेंफिर से हाइड्रेटिंग करके उत्पादित किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि कम गतिविधि के साथ lysates पैदा करती है, संभवतः शेष सेल मलबे के कारण।
lysates सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक सक्रिय हैं, और वे अंत उपयोग के आधार पर विभिन्न तरीकों से बढ़ाया जा सकता है। मानक स्पिन सांती का उपयोग करके लाइसेट को केंद्रित करके प्रोटीन संश्लेषण की दर को और बढ़ाया जा सकता है। लिनेर डीएनए को शुद्ध गम्स प्रोटीन जोड़कर गिरावट से बचाया जा सकता है। प्रोटीन क्षरण, आदोलन जैसे अधिक जटिल सर्किट गतिशीलता के लिए आवश्यक, ऑटोलिसेट-उत्पादक तनाव13में एक ClpX हेक्सामर को सह-व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, लैक्ज़-आधारित दृश्य रीडआउट को लैक्ज़की कमी वाले ऑटोलिस्रेट तनाव का उपयोग करके सक्षम किया जाता है। कुल मिलाकर, यह विधि अत्यधिक सक्रिय सेल-फ्री lysate का उत्पादन करती है जो विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति जीवित जीव की जटिलताओं के बिना जीव विज्ञान की शक्ति प्रदान करती है। हालांकि इस तरह के कई जीन अभिव्यक्ति प्रणाली मौजूद हैं, सबसे खरीदने के लिए काफी महंगे है और/या विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और पतले विशेषज्ञता के लिए प्रभावी ढंग से उत्पादन । यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल सेल-फ्री lysate का उत्पादन करने की एक विधि का वर्णन करता है जो जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर का समर्थन करता है, केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके और न्यूनतम प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। विधि एक एशेरिचिया कोलाई तनाव का उपयोग करती है जो एक एंडोलिसिन का उत्पादन करती है जो विकास को प्रभावित नहीं करती है, लेकिन जो एक साधारण फ्रीज-गल चक्र के बाद एक काटा हुआ सेल गोली को कुशलतापूर्वक lyses करती है। केवल आगे की प्रसंस्करण की आवश्यकता एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन है जिसके बाद सेलुलर मलबे के ऑटोलिसेट को साफ करने के लिए अपकेंद्रित्र किया जाता है। संचयन से पहले कोशिकाओं में ClpX प्रोटीज़ की विषम अभिव्यक्ति के माध्यम से गतिशील जीन सर्किट प्राप्त किया जा सकता है। एक ई. कोलाई तनाव lacZ जीन की कमी उच्च संवेदनशीलता, सेल मुक्त जैव संवेदन अनुप्रयोगों के लिए एक कोलोरिमेट्रिक या फ्लोरोसेंट readout का उपयोग कर इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरे प्रोटोकॉल के रूप में कुछ के रूप में 8-9 घंटे की आवश्यकता है, हाथ के केवल 1-2 घंटे के साथ टीका से पूरा करने के लिए श्रम पर । सेल-फ्री lysate प्राप्त करने के लिए लागत और समय को कम करके, इस विधि को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति की सामर्थ्य में वृद्धि करनी चाहिए।

प्रतिनिधि परिणाम एक संविलियन व्यक्त प्लाज्मिड से GFP व्यक्त करने के लिए ऑटोलाइट का उपयोग करके देखा जा सकता है, यहां pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, और एक प्लेट रीडर(चित्रा 1B)में GFP फ्लोरेसेंस का एक समय पाठ्यक्रम ?...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

यह प्रोटोकॉल सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरियल lysate का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और सरल विधि का वर्णन करता है, एस्चेरिचिया कोलाई के एक इंजीनियर तनाव का उपयोग कर और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है।

बैक्टीरियल सेल-फ्री Lysate का रैपिड, किफायती और सीधी उत्पादन

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उच्च गुणवत्ता वाले बैक्टीरियल सेल lysates केवल मोटे तौर पर उपलब्ध आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति आसानी से ज्यादातर शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बना । एक फ्रीज-गल या फ्रीज-ड्राई चक्र के साथ कार्यक्रम सेलुलर ऑटोलिसिस का संयोजन सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए बैक्टीरियल लाइसेट्स के तेजी से उत्पादन के लिए एक व्यावहारिक, श्रम और लागत प्रभावी दृष्टिकोण बनाने की अनुमति देता है। एक टीका पाश का उपयोग करने के लिए पौंड आगर प्लेटों पर एक ऑटोलिसिस ई. कोलाई तनाव की कोशिकाओं लकीर से शुरू, ३७ डिग्री सेल्सियस प्रति रात में प्लेटों इनक्यूबेट ।अगले दिन, एक पिपेट टिप का उपयोग करके, आगर प्लेट से एक कॉलोनी चुनें और इसे एम्पिसिलिन के साथ एलबी माध्यम युक्त संस्कृति ट्यूब में जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इस स्टार्टर संस्कृति बढ़ें। अगले दिन, स्टार्टर संस्कृति के 400 माइक्रोलीटर को एक लीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में जोड़ें जिसमें 2xYTPG माध्यम के 400 मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पिसिलिन के साथ पूरक होते हैं।३०० आरपीएम पर मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति इनक्यूबेट । एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एक सेंटीमीटर पथ लंबाई के साथ एक ऑप्टिकल क्यूवेट का उपयोग करना, समय-समय पर 600 नैनोमीटर पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापता है। जब ऑप्टिकल घनत्व एक से अधिक हो जाता है, तो माप से पहले संस्कृति को पांच गुना कमजोर करना शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माप एक विशिष्ट प्रयोगशाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की रैखिक सीमा के भीतर रहते हैं।एक बार जब पांच गुना पतला संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व 0.3 तक पहुंच जाता है, तो इनक्यूबेटर से फ्लास्क को हटा दें और lysate तैयार करने के लिए आगे बढ़ें। lysate तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1, 800 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं की कटाई। सुपरनेट को बंद करें और एक पिपेट का उपयोग करके शेष तरल को हटा दें।गोली में 45 मिलीलीटर कोल्ड S30A बफर जोड़ें और पेट को भंवर से फिर से खर्च करें। फिर, कोशिकाओं को ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले एक खाली 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब का वजन करें। कोशिकाओं को फिर से सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।पिपेट का उपयोग करके किसी भी शेष सुपरनेट को एस्पिरेट करें। ट्यूब को फिर से तौलें और गोली का वजन प्राप्त करने के लिए प्रदर्शित वजन से खाली ट्यूब के वजन को घटाएं। सेल पेलेट के हर एक मिलीग्राम के लिए, दो मिलीमोलर डियोथरेटोल के साथ पूरक ठंड S30A बफर के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।इसके बाद जोरदार भंवर से कोशिकाओं को रिसालित करें। इसके बाद, कोशिकाओं को नकारात्मक 20 या नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखकर फ्रीज करें जब तक कि गोली पूरी तरह से जम न जाए, फिर कोशिकाओं को कमरे के तापमान में पानी के स्नान और भंवर को दो से तीन मिनट तक सख्ती से गल लें। ३०० आरपीएम पर मिलाते हुए ४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट, तो पारदर्शी अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अपकेंद्रित्र द्वारा भारी सेलुलर मलबे के नमूने को साफ 30, 000 x ग्राम पर ४५ मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ।ध्यान से एक पिपेट के साथ एक नई ट्यूब के लिए सुपरनेट स्थानांतरित, ध्यान रखना गोली परेशान नहीं है। यदि स्थानांतरित सुपरनेट पैलेट को गोली से सामग्री से दूषित करता है, तो अपकेंद्रित्र को दोहराएं। सुपरनेट को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।और अपकेंद्रित्र एक बार फिर 21, 000 x g या पांच मिनट के लिए एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र की अधिकतम गति पर। Aliquot वांछित मात्रा में मंजूरी दे दी ऑटोलाकार और उपयोग तक शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । ऑटोलिसेट का उपयोग करके सेल-फ्री जीन अभिव्यक्ति के लिए, बर्फ पर ऑटोलिट के आठ माइक्रोलीटर और प्री-मिक्स के 8.9 माइक्रोलीटर मिलाएं।20 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए आठ नैनोमोल्स, किसी भी अन्य आवश्यक अभिकर्ण और पानी की अंतिम एकाग्रता में डीएनए जोड़ें। एक 384-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के लिए प्रतिक्रिया जोड़ें और फ्लोरेसेंस टाइम कोर्स और एंडपॉइंट्स को मापने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करें। प्लाज्मा डीएनए की एक कमजोर करने श्रृंखला के साथ ऑटोलिट का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति एक नैनोमोलर डीएनए के साथ भी मजबूत अभिव्यक्ति में परिणाम देती है।व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lysate और ऑटोलिस्टेट के बीच जीएफपी अभिव्यक्ति की तुलना करने पर, ऑटोलिस्टेट ने जीएफपी के तुलनीय स्तरों का उत्पादन किया। विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा दो अलग-अलग प्रयोगशालाओं में उत्पादित lysate के बैचों के बीच परिवर्तनशीलता लगभग दो गुना के भीतर थी। तीन सबसे महत्वपूर्ण चर सेल गोली बफर अनुपात के लिए कर रहे हैं, मलबे मुक्त supernatant स्थानांतरित करने और अंतिम प्रतिक्रिया में इष्टतम खूंटी और मैग्नीशियम एकाग्रता का उपयोग कर ।एक बार निकालने के लिए तैयार कर लिया गया है, मौजूदा ई.कोलाई सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए विकसित प्रोटोकॉल का एक बड़ा शस्त्रागार इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे ClpXP-मध्यस्थता क्षरण, या AHL-मध्यस्थता कोरम संवेदन ।

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उत्पादन और बैक्टीरियल Spheroplasts और Protoplasts के दृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड स्थानीयकरण की विशेषता के लिए

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

टेलोस्ट मॉडल जापानी मेडाका (ओरीज़ियास लैटिप्स) में शुक्राणु संग्रह और कंप्यूटर-सहायक शुक्राणु विश्लेषण

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक दृढ़ता की जनसंख्या और एकल-कोशिका विश्लेषण

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...