Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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Gli autori ringraziano Zachary Sun e Richard Murray (California Institute of Technology) per aver gentilmente fornito il plasmide P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) per aver gentilmente fornito una centrifuga di raffreddamento ad alta velocità. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health e dal programma ARO MURI ed è stato in parte supportato dalla Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Giappone.

1. Preparare supporti e buffer.
<ol><li>Preparare 2xYTPG medio.<ol>
<li>Mescolare 62 g di polvere 2xYT, 5,99 g di fosfato di potassio monobasico, 13,93 g di fosfato di potassio bibasico e acqua deionizzata a 2 L.</li>
		<li>Autoclave su ciclo liquido con un tempo di esposizione di 30 min14.</li>
		<li>A 400 mL di 2xYTP media da 1.1.2, aggiungere 7,2 g di D-glucosio (destrosio) e mescolare fino a quando non si scioglie.</li>
		<li>Filtrare-sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 μm.</li>
	</ol>...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. 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Il protocollo qui descritto produce lisato batterico altamente attivo per l'espressione genica senza cellule. La chiave è utilizzare cellule portatrici del plasmide pAD-LyseR, che esprime citosolicamente l'endolisina del fago lambda. Queste cellule vengono potenziate per lisarsi dopo la permeabilizzazione della membrana interna, consentendo all'endolisina l'accesso alla parete cellulare, che il metodo ottiene attraverso un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Poiché le cellule si lisano efficacemente, il prodotto vi...

L'espressione genica nei lisati privi di cellule ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule vive1,2,3,4. I lisati possono essere facilmente modificati biochimicamente e utilizzati in condizioni che potrebbero essere dannose o impossibili da ottenere nelle cellule vive. I circuiti di espressione genica non devono competere o competere con i processi biologici dell'ospite e testare nuovi circuiti genetici è semplice come aggiungere DNA. Per questi motivi, l'espressione genica cell-free ha trovato varie applicazioni, dai biosensori5,6 alla prototipazione rapida di circuiti genici sintetici7,8 allo sviluppo di cellule artificiali9. La maggior parte dell'espressione genica senza cellule utilizza lisati cellulari che sono stati altamente elaborati, generalmente richiedendo protocolli lunghi e complessi, attrezzature specializzate e / o passaggi sensibili che possono portare a variazioni significative tra utenti e lotti10,11.
Questo documento descrive un metodo semplice ed efficiente per la produzione di lisato senza cellule che richiede un'elaborazione e un'esperienza minime (Figura 1A)12. Il metodo si basa su cellule di E. coli che sono progettate per lisare seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Le cellule esprimono un'endolisina dal fago lambda che degrada la parete cellulare. Mentre le cellule crescono, questa endolisina rimane nel citoplasma, sequestrata dalla parete cellulare. Tuttavia, un semplice ciclo di congelamento-disgelo interrompe la membrana citoplasmatica, rilasciando l'endolisina nel periplasma, dove degrada la parete cellulare, con conseguente rapida lisi cellulare. Il protocollo può essere completato con poche ore di lavoro pratico e richiede solo un congelatore, una centrifuga capace di 30.000 × g (per risultati ottimali; velocità inferiori possono essere utilizzate con maggiore attenzione per non disturbare il pellet), un miscelatore a vortice e una semplice soluzione tampone. Il lisato funzionale può anche essere prodotto liofilizzando le cellule e reidratandole in situ. Tuttavia, questo metodo produce lisati con attività inferiore, presumibilmente a causa dei detriti cellulari rimanenti.
I lisati sono altamente attivi per l'espressione genica senza cellule e possono essere migliorati in vari modi a seconda dell'uso finale. La velocità di sintesi proteica può essere ulteriormente aumentata concentrando il lisato utilizzando concentratori di spin standard. Il DNA lineare può essere protetto dalla degradazione aggiungendo proteine GamS purificate. La degradazione delle proteine, necessaria per dinamiche circuitali più complesse come l'oscillazione, può essere ottenuta coesprimendo un esamere ClpX nel ceppo13produttore di autolizzato. Infine, le letture visive basate su LacZ sono abilitate utilizzando un ceppo autolizzato privo di lacZ. Nel complesso, questo metodo produce lisato privo di cellule altamente attivo che è adatto per una vasta gamma di applicazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

L'espressione genica senza cellule offre il potere della biologia senza le complicazioni di un organismo vivente. Sebbene esistano molti di questi sistemi di espressione genica, la maggior parte sono piuttosto costosi da acquistare e / o richiedono attrezzature speciali e competenze finemente affinate per produrre in modo efficace. Questo protocollo descrive un metodo per produrre lisato batterico privo di cellule che supporta alti livelli di espressione genica, utilizzando solo apparecchiature di laboratorio standard e richiedendo un'elaborazione minima. Il metodo utilizza un ceppo di Escherichia coli che produce un'endolisina che non influisce sulla crescita, ma che lisa in modo efficiente un pellet cellulare raccolto seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. L'unica ulteriore elaborazione richiesta è una breve incubazione seguita da centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari. I circuiti genici dinamici possono essere ottenuti attraverso l'espressione eterologa della proteasi ClpX nelle cellule prima della raccolta. Un ceppo di E. coli privo del gene lacZ può essere utilizzato per applicazioni di biorilevamento ad alta sensibilità e prive di cellule utilizzando una lettura colorimetrica o fluorescente. L'intero protocollo richiede solo 8-9 ore, con solo 1-2 ore di lavoro pratico dall'inoculazione al completamento. Riducendo i costi e i tempi per ottenere lisato senza cellule, questo metodo dovrebbe aumentare l'accessibilità economica dell'espressione genica senza cellule per varie applicazioni.

I risultati rappresentativi possono essere osservati utilizzando l'autolizzato per esprimere GFP da un plasmide che esprime costitutivamente, qui pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, e registrando un corso temporale di fluorescenza GFP in un lettore di piastre (Figura 1B). Una serie di diluizione di DNA plasmidico ha trovato una forte espressione anche a 1 nM di DNA. Rispetto ad un lisato disponibile in commercio, l'autolizzato può produrre una maggiore resa totale e raggiungere un maggiore ta...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.

Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Utilizzando questo protocollo, i lisati cellulari batterici di alta qualità possono essere prodotti utilizzando solo apparecchiature di laboratorio comuni ampiamente disponibili, rendendo l'espressione genica senza cellule facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La combinazione dell'autolisi cellulare del programma con un ciclo di congelamento-disgelo o liofilizzazione consente di creare un approccio pratico, laborioso ed economico per una rapida produzione di lisati batterici per l'espressione genica senza cellule. Iniziare utilizzando un ciclo di inoculazione per strisciare le cellule di un ceppo di autolisi di E.coli su piastre di agar LB contenenti 50 microgrammi per millilitro ampicillina, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, usando una punta di pipetta, prelevare una singola colonia dalla piastra di agar e aggiungerla in un tubo di coltura contenente LB medium con ampicillina. Coltiva questa cultura di avviamento a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 400 microlitri della coltura di avviamento in un pallone Erlenmeyer da un litro contenente 400 millilitri di mezzo 2xYTPG integrato con 50 microgrammi per millilitro ampicillina.Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 300 RPM. Utilizzando uno spettrofotometro e una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di un centimetro, misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando la densità ottica supera una, iniziare a diluire la coltura cinque volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio.Una volta che la densità ottica della coltura diluita a cinque volte raggiunge 0,3, rimuovere il matraccio dall'incubatrice e procedere alla preparazione del lisato. Per preparare il lisato, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.800 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante e rimuovere il liquido rimanente usando una pipetta.Aggiungere 45 millilitri di tampone S30A freddo al pellet e risospesciare il pellet mediante vortice. Quindi, pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 millilitri prima di trasferire le celle nel tubo. Centrifugare nuovamente le cellule e scartare il surnatante.Aspirare qualsiasi surnatante rimanente usando una pipetta. Pesare nuovamente il tubo e sottrarre il peso del tubo vuoto dal peso visualizzato per ottenere il peso del pellet. Per ogni milligrammo di pellet cellulare, aggiungere due microlitri di tampone S30A freddo integrato con due millimolari ditiotreitolo.Quindi, risospese le cellule con un vigoroso vortice. Quindi, congelare le cellule mettendole in un congelatore negativo a 20 o 80 gradi Celsius negativo fino a quando il pellet non è completamente congelato, quindi scongelare le celle a bagnomaria a temperatura ambiente e vorticare vigorosamente per due o tre minuti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 45 minuti con agitazione a 300 RPM, quindi eliminare il campione di detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifughi trasparenti a 30.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire con cura il surnatante in un tubo nuovo con una pipetta, avendo cura di non disturbare il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale del pellet, ripetere la centrifugazione. Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.E centrifuga ancora una volta a 21.000 x g o alla velocità massima di una centrifuga da tavolo per cinque minuti. Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Per l'espressione genica senza cellule utilizzando l'autolizzato, mescolare otto microlitri di autolizzato e 8,9 microlitri di premiscela su ghiaccio.Aggiungere DNA a una concentrazione finale di otto nanomoli, qualsiasi altro reagente necessario e acqua per ottenere un volume finale di 20 microlitri. Aggiungere la reazione a una micropiastra a 384 pozzetti e utilizzare un lettore di piastre per misurare il decorso temporale di fluorescenza e gli endpoint. L'espressione GFP utilizzando l'autolizzato con una serie di diluizioni di DNA plasmatico si traduce in una forte espressione anche con un DNA nanomolare.Confrontando l'espressione GFP tra un lisato disponibile in commercio e l'autolizzato, l'autolizzato ha prodotto livelli comparabili di GFP. La variabilità tra lotti di lisato prodotti in due diversi laboratori da diversi ricercatori era di circa due volte. Le tre variabili più critiche sono il rapporto pellet/tampone cellulare, il trasferimento di surnatante privo di detriti e l'utilizzo di una concentrazione ottimale di PEG e magnesio nella reazione finale.Una volta che l'estratto è stato preparato, è possibile utilizzare un ampio arsenale di protocolli esistenti sviluppati per i sistemi di espressione libera da cellule di E.coli, come la degradazione mediata da ClpXP o il quorum sensing mediato da AHL.

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