Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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著者らは、ザカリー・サンとリチャード・マレー(カリフォルニア工科大学)がプラスミドP_araBADガムを提供してくれたこと、亀井佳子(京都工業大学)が高速冷却遠心分離機を親切に提供してくれたことに感謝する。この研究は、国立衛生研究所とARO MURIプログラムからの助成金によって支えられ、一部は優秀な若い研究者のためのリーディングイニシアチブ、MEXT、日本によって支援されました。

1. メディアとバッファを準備します。
<ol><li>2xYTPG培地を準備します。<ol>
<li>62g 2xYT粉末、5.99gリン酸カリウム一塩基、13.93gのリン酸カリウム二塩基、および2Lに脱イオン水を混合する。</li>
		<li>30分14の露出時間を持つ液体サイクル上のオートクレーブ。</li>
		<li>1.1.2から2xYTP培地の400mLに、7.2 gのD-グルコース(デキストロース)を加え、溶解するまで混ぜます。</li>
		<li>0.2 μmフ...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、無細胞遺伝子発現に対して非常に活性な細菌ライセートを生み出す。鍵は、細胞内に内反するラムダファージを発現するプラスミドpAD-LyseRを運ぶ細胞を使用することです。これらの細胞は、内膜の透過化時に自分自身を溶分解するように増強され、単純な凍結融解サイクルを通じて得られた細胞壁への内層リンアクセスを可能にする。細胞は効果的に自分自身?...

無細胞ライセートにおける遺伝子発現は、生細胞1、2、3、4を使用する上で、いくつかの利点がある。ライセートは生化学的に簡単に改変でき、生細胞で達成することが有害または不可能な条件で使用することができます。遺伝子発現回路は、ホスト生物学的プロセスと競合したり、競合したりする必要は一つではなく、新しい遺伝子回路のテストはDNAを追加するのと同じくらい簡単です。これらの理由から、無細胞遺伝子発現は、バイオセンサー5、6から合成遺伝子回路7、8の迅速なプロトタイピング、人工細胞9の開発まで、様々な応用を見つけた。ほとんどの無細胞遺伝子発現は、高度に処理された細胞ライセートを利用し、一般的に長く複雑なプロトコル、特殊な装置、および/または感受性の高いステップを必要とし、ユーザとバッチ10,11の間で大きな変動を引き起こす可能性がある。
この論文では、最小限の処理と専門知識を必要とする無細胞ライセートを製造するためのシンプルで効率的な方法について説明します(図1A)12。この方法は、単純な凍結融解サイクルに従ってライスするように設計された大腸菌細胞に依存する。細胞は、細胞壁を分解するファージラムダから内層分解物を発現する。細胞が成長するにつれて、この内層は細胞質に残り、細胞壁から隔離される。しかし、単純な凍結融解サイクルは細胞質膜を破壊し、子宮内膜を細胞壁を分解する周辺に放出し、細胞の分解を引き起こし、細胞の分解を迅速に生じる。このプロトコルは、わずか数時間の実践的な作業で完了することができ、冷凍庫、30,000×g(最適な結果のために;ペレットを乱さないより注意して低速を使用できる)、渦ミキサー、および簡単なバッファソリューションのみを必要とします。機能性ライセートは、細胞を凍結乾燥させてその現場で再水和することによっても生成することができる。しかし、この方法は、おそらく残りの細胞の破片のために、より低い活性を有するライセートを生成する。
ライゼートは無細胞遺伝子発現に対して非常に活性であり、最終的な使用に応じて様々な方法で増強することができる。タンパク質合成の速度は、標準的なスピン濃縮器を使用してライセートを濃縮することによってさらに増加させることができる。リニアDNAは、精製GamSタンパク質を添加することで分解から保護することができます。タンパク質分解は、振動などのより複雑な回路ダイナミクスに必要であり、自動分解物生成株13においてClpXヘキサマーを共発現させることによって達成できる。最後に、LacZ ベースのビジュアル読み出しは 、lacZを欠いている自動分解歪みを使用して有効になります。全体的に、この方法は、幅広い用途に適した高活性細胞フリーのライセートを生成する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

無細胞遺伝子発現は、生物の合併症を伴わない生物学の力を提供する。このような遺伝子発現システムの多くは存在しますが、ほとんどは購入に非常に高価であり、また/または、効果的に生産するために特別な機器と細かく磨かれた専門知識を必要とします。このプロトコルは、標準的な実験室装置のみを使用し、最小限の処理を必要とする高レベルの遺伝子発現をサポートする細菌無細胞ライセートを生成する方法を記述する。この方法は、成長に影響を与えないが、簡単な凍結融解サイクルに続いて収穫された細胞ペレットを効率的に融解する内生リンジンを産生する大腸菌株を使用する。必要な唯一のさらなる処理は、細胞の破片の自己起質をクリアするために遠心分離に続く短いインキュベーションです。動的遺伝子回路は、収穫前に細胞内のClpXプロテアーゼの異種発現によって達成することができる。lacZ遺伝子を欠いた大腸菌株は、着色または蛍光読み出しを使用して高感度、無細胞バイオセンシングアプリケーションに使用できます。プロトコル全体は8-9時間しか必要としませんが、接種から完了までの実習作業は1〜2時間です。無細胞のライセートを得るためのコストと時間を削減することによって、この方法は、様々なアプリケーションのための無細胞遺伝子発現の手頃な価格を高める必要があります。

代表的な結果は、構成的に発現するプラスミドからGFPを発現するために自己分解物を用いることによって観察され得る、ここでpBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500、およびGFP蛍光の時間経過をプレートリーダーに記録する(図1B)。プラスミドDNAの希釈系列は、1nM DNAでも強い発現を発見した。市販のライセートと比較して、オートリセートは、GFP時間経過の時間誘導体として計算され...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌 の設計された株を使用し、標準的な実験装置のみを必要とする、無細胞遺伝子発現のための細菌リセートを生成するための迅速かつ簡単な方法を記述する。

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

このプロトコルを使用すると、高品質の細菌細胞ライセートは、広く利用可能な一般的な実験室装置のみを使用して製造することができ、ほとんどの研究者が無細胞遺伝子発現を容易に利用できるようにします。プログラムの細胞の自己起液を凍結融解または凍結乾燥サイクルと組み合わせることで、無細胞遺伝子発現のための細菌のライセートを迅速に生産するための実用的で手間と費用対効果の高いアプローチを作成できます。接種ループを使用して、自己融解大腸菌株の細胞を1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを含むLB寒天プレートにストリークし、一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、ピペットチップを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを選び、アンピシリンを含むLB培地を含む培養管に加える。このスターターカルチャーを一晩で摂氏37度で育ててください。翌日、400マイクロリットルのスターター培養液を1リットルのエルレンマイヤーフラスコに加え、2xYTPG培地の400ミリリットルを含み、ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを添加する。300 RPMで振ると37°Cで培養します。分光光度計と1センチメートルのパス長を持つ光学キュベットを使用して、600ナノメートルで培養物の光学密度を定期的に測定します。光学密度が1を超えた場合、測定前に培養物を5倍希釈し、測定が典型的な実験室分光光度計の線形範囲内に留まることを確認します。5倍希釈培養の光学濃度が0.3に達したら、培養器からフラスコを取り出し、リセートの調製に進みます。ライセートを調製するために、1,800xgで遠心分離により細胞を室温で15分間収穫する。上清を注ぎ、ピペットを使用して残りの液体を取り除きます。45ミリリットルの冷たいS30Aバッファーをペレットに加え、渦によってペレットを再懸濁する。次いで、細胞をチューブに移す前に、空の50ミリリットル遠心管を秤量する。再び細胞を遠心分離し、上清を捨てます。ピペットを使用して残りの上清を吸引する。チューブの重量を再測定し、表示された重量から空のチューブの重量を差し引いてペレットの重量を得ます。細胞ペレットの1ミリグラムごとに, 2 ミリモルジチオトレイトールを補った冷たい S30A バッファーの 2 マイクロリットルを追加します。.次に、激しい渦を流して細胞を再懸濁する。次に、ペレットが完全に凍結するまでマイナス20度またはマイナス80度の冷凍庫に入れて細胞を凍結し、室温の水浴で細胞を解凍し、2〜3分間激しく渦を抜けます。300 RPMで揺れで45分間摂氏37度で細胞をインキュベートし、透明遠心管で30,000 x gの遠心分離機で45分摂氏4度で重い細胞の破片のサンプルを取り除きます。慎重にペレットを乱さないよう注意して、ピペットで新しいチューブに上清を転送します。移管された上清がペレットからの材料で汚染されている場合は、遠心分離を繰り返します。上清を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。そして、遠心分離機は21、000 x gまたは5分間卓上遠心分離機の最高速度でもう一度。アリコートクリアされた自動調整は、所望のボリュームにし、使用するまでマイナス80度で保存します。自己駆処理を用いた無細胞遺伝子発現の場合、8マイクロリットルの自己自動処理物と8.9マイクロリットルのプレミックスを氷上に混合します。DNAを8ナノモルの最終濃度に加え、他の必要な試薬と水を加え、20マイクロリットルの最終体積を得る。384ウェルマイクロプレートに反応を加え、プレートリーダーを使用して蛍光時間の経過およびエンドポイントを測定します。血漿DNAの希釈系列を用いた自己溶解物を用いたGFP発現は、ナノモルDNAを1個でも強く発現する。市販のライセートとオートリセートの間でGFP発現を比較すると、オートリセートは同等のレベルのGFPを産生した。異なる研究者によって2つの異なる実験室で作製されたライセートのバッチ間の変動は、約2倍以内であった。3つの最も重要な変数は、細胞ペレット対緩衝比であり、デブリを含まない上清を移動し、最終的な反応で最適なPEGおよびマグネシウム濃度を使用します。抽出が準備されると、ClpXP媒介劣化やAHL媒介クォーラムセンシングなど、大腸菌細胞フリー発現システム用に開発された既存のプロトコルの大規模な兵器を使用できます。

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