Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Forfatterne takker Zachary Sun og Richard Murray (California Institute of Technology) for vennlig å gi plasmid P_araBAD-gamS, og Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) for vennlig å gi en høyhastighets kjølesentrifuge. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health og fra ARO MURI-programmet og ble delvis støttet av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.

1. Klargjør medier og buffere.
<ol><li>Forbered 2xYTPG medium.<ol>
<li>Bland 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumfosfatmonobasisk, 13,93 g kaliumfosfatdibasisk og deionisert vann til 2 L.</li>
		<li>Autoklav på væskesyklus med en eksponeringstid på 30 min14.</li>
		<li>Til 400 ml 2xYTP-medier fra 1,1,2 tilsettes 7,2 g D-glukose (dekstrose) og bland til det er oppløst.</li>
		<li>Filtrer steriliser gjennom et filter på 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør S30A-buffer.<ol>
<li>Bland Tris-HCl...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

Protokollen som beskrives her gir svært aktiv bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk. Nøkkelen er å bruke celler som bærer plasmid pAD-LyseR, som uttrykker lambda phage endolysin cytosolisk. Disse cellene er forsterket for å lyse seg ved permeabilisering av den indre membranen, slik at endolysintilgangen til celleveggen, som metoden oppnår gjennom en enkel fryse-tine syklus. Fordi cellene effektivt lyser seg selv, blir produktet referert til som autolysat. Etter at cellene har lysnet, er de eneste gjenværende ...

Genuttrykk i cellefrie lysater har flere fordeler i forhold til å bruke levende celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifiseres biokjemisk og brukes under forhold som kan være skadelige for eller umulig å oppnå i levende celler. Genuttrykkskretser trenger ikke å kjempe eller konkurrere med vertsbiologiske prosesser, og testing av nye genetiske kretser er så enkelt som å legge til DNA. Av disse grunnene har cellefritt genuttrykk funnet ulike bruksområder, fra biosensorer5,6 til raskt prototyping av syntetiske genkretser7,8 til utvikling av kunstige celler9. De fleste cellefrie genuttrykk bruker cellulære lysater som har blitt svært bearbeidet, og som vanligvis krever lange og komplekse protokoller, spesialutstyr og/eller sensitive trinn som kan føre til betydelig variasjon mellom brukere og partier10,11.
Dette dokumentet beskriver en enkel, effektiv metode for å produsere cellefri lysat som krever minimal behandling og ekspertise (Figur 1A)12. Metoden er avhengig av E. coli-celler som er konstruert for å lyse etter en enkel fryse-tine syklus. Cellene uttrykker en endolysin fra phage lambda som forringer celleveggen. Etter hvert som cellene vokser, forblir denne endolysinen i cytoplasma, beslaglagt fra celleveggen. Imidlertid forstyrrer en enkel fryse-tining syklus den cytoplasmatiske membranen, frigjør endolysin i periplasma, hvor den forringer celleveggen, noe som resulterer i rask cellelys. Protokollen kan fullføres med bare noen få timers praktisk arbeid og krever bare en fryser, en sentrifuge som er i stand til 30.000 × g (for optimale resultater; lavere hastigheter kan brukes med mer forsiktighet for ikke å forstyrre pellet), en virvelblander og en enkel bufferløsning. Funksjonell lysat kan til og med produseres ved å fryse tørking av cellene og rehydrere dem in situ. Denne metoden produserer imidlertid lysater med lavere aktivitet, antagelig på grunn av gjenværende celleavfall.
Lysatene er svært aktive for cellefritt genuttrykk, og de kan forbedres på forskjellige måter avhengig av sluttbruken. Frekvensen av proteinsyntese kan økes ytterligere ved å konsentrere lysatet ved hjelp av standard spinnkonsentratorer. Lineært DNA kan beskyttes mot nedbrytning ved å tilsette renset GamS-protein. Proteinforringelse, som er nødvendig for mer kompleks kretsdynamikk som oscillasjon, kan oppnås ved å uttrykke en ClpX-heksamer i den autolyserende produserende stammen13. Til slutt aktiveres LacZ-baserte visuelle avlesninger ved hjelp av en autolysert belastning som mangler lacZ. Totalt sett produserer denne metoden svært aktiv cellefri lysat som passer for et bredt spekter av applikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

Cellefritt genuttrykk gir biologiens kraft uten komplikasjoner av en levende organisme. Selv om mange slike genuttrykkssystemer eksisterer, er de fleste ganske dyre å kjøpe og / eller krever spesialutstyr og fin finpusset kompetanse for å produsere effektivt. Denne protokollen beskriver en metode for å produsere bakteriell cellefri lysat som støtter høye nivåer av genuttrykk, ved hjelp av bare standard laboratorieutstyr og krever minimal behandling. Metoden bruker en Escherichia coli-stamme som produserer en endolysin som ikke påvirker veksten, men som effektivt lyser en høstet cellepellet etter en enkel fryse-tining syklus. Den eneste videre behandlingen som kreves er en kort inkubasjon etterfulgt av sentrifugering for å fjerne autolysat av cellulært rusk. Dynamiske genkretser kan oppnås gjennom heterologt uttrykk for ClpX-protease i cellene før høsting. En E. coli-stamme som mangler lacZ-genet, kan brukes til høysensitive, cellefrie biosensing-applikasjoner ved hjelp av en kolorimetrisk eller fluorescerende avlesning. Hele protokollen krever så få som 8-9 timer, med bare 1-2 timer praktisk arbeid fra inokulasjon til ferdigstillelse. Ved å redusere kostnadene og tiden for å oppnå cellefri lysat, bør denne metoden øke overkommeligheten av cellefritt genuttrykk for ulike applikasjoner.

Representative resultater kan observeres ved å bruke automatisk til å uttrykke GFP fra en konstituativt uttrykke plasmid, her pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, og registrere et tidsforløp for GFP fluorescens i en plateleser (Figur 1B). En fortynningsserie av plasmid DNA fant sterkt uttrykk selv ved 1 nM DNA. Sammenlignet med et kommersielt tilgjengelig lysat, kan autolysatet gi større total avkastning og oppnådde en større maksimal produksjonsrate, beregnet som tidsderivat for GFP-tids...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å produsere bakteriell lysat for cellefritt genuttrykk, ved hjelp av en konstruert stamme av Escherichia coli og krever bare standard laboratorieutstyr.

Rask, rimelig og ukomplisert produksjon av bakteriell cellefri lysat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Ved hjelp av denne protokollen kan bakterieceller av høy kvalitet produseres ved hjelp av bare bredt tilgjengelig vanlig laboratorieutstyr, noe som gjør cellefritt genuttrykk lett tilgjengelig for de fleste forskere. Kombinere program cellulær autolyse med en fryse-tine eller fryse-tørr syklus gjør det mulig å skape en praktisk, arbeidskraft og kostnadseffektiv tilnærming for rask produksjon av bakterielle lysater for cellefri genuttrykk. Begynn med å bruke en inokulasjonssløyfe for å strekke cellene i en autolyse E.coli-stamme på LB agarplater som inneholder 50 mikrogram per milliliter ampicillin, og inkuber deretter platene ved 37 grader Celsius over natten.Neste dag, ved hjelp av en pipettespiss, velger du en enkelt koloni fra agarplaten og legger den til i et kulturrør som inneholder LB-medium med ampicillin. Vokse denne startkulturen på 37 grader Celsius over natten. Neste dag legger du til 400 mikroliter av startkulturen i en en liter Erlenmeyer-kolbe som inneholder 400 milliliter 2xYTPG medium supplert med 50 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius med risting ved 300 RPM. Bruk et spektrofotometer og en optisk cuvette med en en centimeter banelengde, og mål regelmessig kulturens optiske tetthet ved 600 nanometer. Når den optiske tettheten overstiger en, begynner du å fortynne kulturen fem ganger før målinger for å sikre at målingene forblir innenfor det lineære området til et typisk laboratoriespektrofotometer.Når den optiske tettheten til den femdelte fortynnede kulturen når 0,3, fjern kolben fra inkubatoren og fortsett å forberede lysatet. For å forberede lysatet, høst cellene ved sentrifugering ved 1800 x g i 15 minutter ved romtemperatur. Hell av supernatanten og fjern den gjenværende væsken ved hjelp av en pipette.Tilsett 45 milliliter kald S30A buffer til pelletsen og resuspend pellet ved virveling. Vei deretter et tomt sentrifugerør på 50 milliliter før du overfører cellene til røret. Sentrifuger cellene igjen og kast supernatanten.Aspirer eventuelle gjenværende supernatanter ved hjelp av en pipette. Vei røret igjen og trekk vekten av det tomme røret fra vekten som vises for å oppnå pelletsvekten. For hvert milligram cellepellet, tilsett to mikroliter kald S30A buffer supplert med to millimolar dithiothreitol.Deretter bruker du cellene på nytt ved kraftig virveling. Deretter fryser du cellene ved å plassere dem i en negativ 20 eller negativ 80 grader Celsius fryser til pelletsen er grundig frosset, og tin deretter cellene i et vannbad i romtemperatur og virvel kraftig i to til tre minutter. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 45 minutter med risting ved 300 RPM, og fjern deretter prøven av tungt cellulært rusk ved å sentrifugere i gjennomsiktige sentrifugerør ved 30.000 x g i 45 minutter ved fire grader Celsius.Overfør forsiktig supernatanten til et nytt rør med en pipette, pass på at du ikke forstyrrer pelletsen. Hvis det overførte supernatantet er forurenset med materiale fra pellets, gjenta sentrifugeringen. Overfør supernatanten til 1,5 milliliter sentrifugerør.Og sentrifuger igjen på 21.000 x g eller maksimal hastighet på en bordplate sentrifuge i fem minutter. Aliquot den ryddede autolysate i ønskede volumer og lagre på minus 80 grader Celsius til bruk. For cellefritt genuttrykk ved hjelp av autolysatet blander du åtte mikroliter autolysere av autolysat og 8,9 mikroliter pre-mix på is.Legg DNA til en endelig konsentrasjon på åtte nanomoles, andre nødvendige reagenser og vann for å oppnå et endelig volum på 20 mikroliter. Tilsett reaksjonen på en 384-brønns mikroplate og bruk en plateleser til å måle fluorescenstidskurset og endepunktene. GFP-uttrykk ved hjelp av autolysat med en fortynningsserie av plasma-DNA resulterer i sterkt uttrykk selv med ett nanomolar-DNA.Ved sammenligning av GFP-uttrykket mellom et kommersielt tilgjengelig lysat og autolysatet, produserte autolysatet sammenlignbare nivåer av GFP. Variasjon mellom partier med lysat produsert i to forskjellige laboratorier av forskjellige forskere var innenfor omtrent todelt. De tre mest kritiske variablene er cellepellet til bufferforhold, overføring av ruskfri supernatant og bruk av optimal PEG- og magnesiumkonsentrasjon i den endelige reaksjonen.Når ekstraktet er klargjort, kan et stort arsenal av eksisterende protokoller utviklet for E.coli cellefrie uttrykkssystemer brukes, for eksempel ClpXP-mediert nedbrytning, eller AHL-mediert quorumssensor.

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Analysere proteasomal Nedsatt en Cell-free systemet i planter

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

Bygging av en rimelig og enkel å bygge Sebrafisk Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid DNA Extraction Method for kvalitativ og kvantitativ vurdering av bakteriesamfunn fra fjærfe produksjon Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualisering og Kvantifisering av Cell-free Layer i arterioler av Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Produksjon og visualisering av bakteriell Spheroplasts og Protoplasts for å karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Sperm Collection og dataassistert Sperm analyse i Teleost Model japansk Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Populasjons- og enkeltcelleanalyse av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

Metoder for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner i makroskala hydrogeler

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...