Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
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Los autores agradecen a Zachary Sun y Richard Murray (Instituto de Tecnología de California) por proporcionar amablemente el plásmido P_araBAD-gamS, y a Kaeko Kamei (Instituto de Tecnología de Kyoto) por proporcionar amablemente una centrífuga de enfriamiento de alta velocidad. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y del programa ARO MURI y fue apoyado en parte por la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes, MEXT, Japón.

1. Prepare medios y búferes.
<ol><li>Preparar el medio 2xYTPG.<ol>
<li>Mezcle 62 g de polvo de 2xYT, 5,99 g de fosfato de potasio monobásico, 13,93 g de fosfato de potasio dibásico y agua desionizada a 2 L.</li>
		<li>Autoclave en ciclo líquido con un tiempo de exposición de 30 min14.</li>
		<li>A 400 ml de medios 2xYTP de 1.1.2, agregue 7.2 g de D-glucosa (dextrosa) y mezcle hasta que se disuelva.</li>
		<li>Filtro-esterilizar a través de un filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepa...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. 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El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efe...

La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores5,6 hasta la rápida creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos7,8 y el desarrollo de células artificiales9. La mayoría de la expresión génica libre de células utiliza lisados celulares que han sido altamente procesados, generalmente requieren protocolos largos y complejos, equipos especializados y / o pasos sensibles que pueden conducir a una variación significativa entre los usuarios y los lotes10,11.
Este documento describe un método simple y eficiente para producir lisado libre de células que requiere un procesamiento y experiencia mínimos(Figura 1A)12. El método se basa en células de E. coli que están diseñadas para lisarse después de un simple ciclo de congelación-descongelación. Las células expresan una endolisina del fago lambda que degrada la pared celular. A medida que las células crecen, esta endolisina permanece en el citoplasma, secuestrada de la pared celular. Sin embargo, un simple ciclo de congelación-descongelación interrumpe la membrana citoplasmática, liberando la endolisina en el periplasma, donde degrada la pared celular, lo que resulta en una rápida lisis celular. El protocolo se puede completar con solo unas pocas horas de trabajo práctico y solo requiere un congelador, una centrífuga capaz de 30,000 × g (para obtener resultados óptimos; se pueden usar velocidades más bajas con más cuidado para no molestar el pellet), un mezclador de vórtice y una solución tampón simple. El lisado funcional puede incluso producirse mediante la liofilización de las células y su rehidratación in situ. Sin embargo, este método produce lisados con menor actividad, presumiblemente debido a los restos celulares restantes.
Los lisados son altamente activos para la expresión génica libre de células, y se pueden mejorar de varias maneras dependiendo del uso final. La tasa de síntesis de proteínas se puede aumentar aún más concentrando el lisado utilizando concentradores de espín estándar. El ADN lineal se puede proteger de la degradación mediante la adición de proteína GamS purificada. La degradación de proteínas, necesaria para una dinámica de circuitos más compleja como la oscilación, se puede lograr coexpresando un hexámero ClpX en la cepa productora de autolisato13. Finalmente, las lecturas visuales basadas en LacZ se habilitan mediante el uso de una tensión de autolisado que carece de lacZ. En general, este método produce lisado libre de células altamente activo que es adecuado para una amplia gama de aplicaciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.

Los resultados representativos se pueden observar mediante el uso de autolisado para expresar GFP a partir de un plásmido que expresa constitutivamente, aquí pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, y registrando un curso de tiempo de fluorescencia de GFP en un lector de placas (Figura 1B). Una serie de dilución de ADN plásmido encontró una fuerte expresión incluso a 1 nM de ADN. En comparación con un lisado disponible comercialmente, el autolisato puede producir un mayor rendimiento total y...

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Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.

Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Usando este protocolo, los lisados celulares bacterianos de alta calidad se pueden producir utilizando solo equipos de laboratorio comunes ampliamente disponibles, lo que hace que la expresión génica libre de células sea fácilmente accesible para la mayoría de los investigadores. La combinación de la autólisis celular del programa con un ciclo de congelación-descongelación o liofilización permite crear un enfoque práctico, laboral y rentable para la producción rápida de lisados bacterianos para la expresión génica libre de células. Comience usando un asa de inoculación para rayar las células de una cepa de E. coli de autólisis en placas de agar LB que contienen 50 microgramos por mililitro de ampicilina, luego incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, usando una punta de pipeta, recoja una sola colonia de la placa de agar y agréguela a un tubo de cultivo que contenga medio LB con ampicilina. Cultive este cultivo iniciador a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue 400 microlitros del cultivo iniciador en un matraz Erlenmeyer de un litro que contenga 400 mililitros de medio 2xYTPG complementado con 50 microgramos por mililitro de ampicilina.Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a 300 RPM. Utilizando un espectrofotómetro y una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de un centímetro, mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Cuando la densidad óptica exceda una, comience a diluir el cultivo cinco veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico.Una vez que la densidad óptica del cultivo diluido quíntuple alcance 0.3, retire el matraz de la incubadora y proceda a preparar el lisado. Para preparar el lisado, cosecha las células por centrifugación a 1, 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante y retire el líquido restante con una pipeta.Agregue 45 mililitros de tampón frío S30A al pellet y vuelva a suspender el pellet mediante vórtice. Luego, pese un tubo de centrífuga vacío de 50 mililitros antes de transferir las células al tubo. Centrifuga las células de nuevo y descarta el sobrenadante.Aspire cualquier sobrenadante restante usando una pipeta. Pesar el tubo de nuevo y restar el peso del tubo vacío del peso mostrado para obtener el peso del pellet. Por cada miligramo de pellet celular, agregue dos microlitros de tampón frío S30A complementado con dos ditiotreitol milimolar.Luego, resuspende las células mediante vórtice vigoroso. A continuación, congele las células colocándolas en un congelador negativo de 20 o 80 grados centígrados negativos hasta que el pellet esté completamente congelado, luego descongele las células en un baño de agua a temperatura ambiente y vórtice vigorosamente durante dos o tres minutos. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 45 minutos con agitación a 300 RPM, luego limpiar la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30, 000 x g durante 45 minutos a cuatro grados Celsius.Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita la centrifugación. Transfiera el sobrenadante a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.Y centrifugar una vez más a 21, 000 x g o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa durante cinco minutos. Aliquote el autolisado despejado en los volúmenes deseados y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para la expresión génica libre de células utilizando el autolizado, mezcle ocho microlitros de autolizado y 8,9 microlitros de premezclado en hielo.Añadir ADN a una concentración final de ocho nanomoles, cualquier otro reactivo necesario y agua para obtener un volumen final de 20 microlitros. Agregue la reacción a una microplaca de 384 pocillos y use un lector de placas para medir el curso del tiempo de fluorescencia y los puntos finales. La expresión de GFP utilizando el autolizado con una serie de dilución de ADN plasmático da como resultado una expresión fuerte incluso con un ADN nanomolar.Al comparar la expresión GFP entre un lisado disponible comercialmente y el autolizado, el autolisato produjo niveles comparables de GFP. La variabilidad entre los lotes de lisado producidos en dos laboratorios diferentes por diferentes investigadores fue de aproximadamente dos veces. Las tres variables más críticas son la relación de pellet celular a tampón, la transferencia de sobrenadante libre de escombros y el uso de una concentración óptima de PEG y magnesio en la reacción final.Una vez que se ha preparado el extracto, se puede utilizar un gran arsenal de protocolos existentes desarrollados para los sistemas de expresión libre de células de E. coli, como la degradación mediada por ClpXP o la detección de quórum mediada por AHL.

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