Name: rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Författarna tackar Zachary Sun och Richard Murray (California Institute of Technology) för att de vänligt tillhandahåller plasmiden P_araBAD-gamS, och Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) för att vänligt ha tillhandahållit en höghastighetskylningscentrug. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health och från ARO MURI-programmet och stöddes delvis av Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.

1. Förbered media och buffertar.
<ol><li>Förbered 2xYTPG medium.<ol>
<li>Blanda 62 g 2xYT pulver, 5,99 g kaliumfosfat monobasiskt, 13,93 g kaliumfosfatdibasiskt och avjoniserat vatten till 2 L.</li>
		<li>Autoklav på vätskecykel med en exponeringstid på 30 min14.</li>
		<li>Tillsätt 7,2 g D-glukos (dextros) till 400 ml 2xYTP-media från 1.1.2 och blanda tills det är upplöst.</li>
		<li>Filtersterilisera genom ett 0,2 μm-filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered S30A-bufferten.<ol>
<li>Bl...

<ol>
	<li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+metabolic+engineering:+biomanufacturing+beyond+the+cell.">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+in+proteomics+and+biotechnology.">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+"breadboard".">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li><li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells.">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027 (2018).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).</li><li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems.">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li><li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression.">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li><li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation.">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li><li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases.">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li><li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems.">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li><li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption.">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här ger mycket aktiv bakteriell lysate för cell-free genuttryck. Nyckeln är att använda celler som bär plasmid pAD-LyseR, som uttrycker lambda phage endolysin cytosolically. Dessa celler förstärks för att lysa sig vid permeabilisering av det inre membranet, vilket ger endolysin tillgång till cellväggen, vilket metoden uppnår genom en enkel frys-tina cykel. Eftersom cellerna effektivt lyses sig, kallas produkten autolysate. Efter att cellerna har lyst är de enda återstående stegen in...

Genuttryck i cellfria lysater har flera fördelar jämfört med att använda levande celler1,2,3,4. Lysater kan enkelt modifieras biokemiskt och användas under förhållanden som kan vara skadliga för eller omöjliga att uppnå i levande celler. Genuttryckskretsar behöver inte kämpa eller konkurrera med värdbiologiska processer, och att testa nya genetiska kretsar är lika enkelt som att lägga till DNA. Av dessa skäl har cellfritt genuttryck hittat olika tillämpningar, från biosensorer5,6 till snabbt prototyping syntetiska genkretsar7,8 till att utveckla konstgjorda celler9. De flesta cellfria genuttryck använder cellulära lysater som har bearbetats mycket, vilket i allmänhet kräver långa och komplexa protokoll, specialiserad utrustning och / eller känsliga steg som kan leda till betydande variation mellan användare och partier10,11.
Detta dokument beskriver en enkel och effektiv metod för att producera cellfri lysat som kräver minimal bearbetning och expertis (figur 1A)12. Metoden bygger på E. coli-celler som är konstruerade för att lysa efter en enkel frys-tina cykel. Cellerna uttrycker en endolysin från faglamda som försämrar cellväggen. När cellerna växer förblir denna endolysin i cytoplasman, separerad från cellväggen. En enkel frys-tina cykel stör dock cytoplasmamembranet, släpper endolysin i periplasman, där det försämrar cellväggen, vilket resulterar i snabb celllys. Protokollet kan slutföras med endast några timmars praktiskt arbete och kräver endast en frys, en centrifug som kan 30 000 × g (för optimalt resultat; lägre hastigheter kan användas med större omsorg för att inte störa pelleten), en virvelblandare och en enkel buffertlösning. Funktionell lysat kan till och med produceras genom att frysa cellerna och rehydrera dem på plats. Denna metod producerar dock lysater med lägre aktivitet, förmodligen på grund av de återstående cellresterna.
Lysaterna är mycket aktiva för cellfria genuttryck, och de kan förbättras på olika sätt beroende på slutanvändningen. Proteinsyntesen kan ökas ytterligare genom att lysate koncentreras med hjälp av vanliga spinnkoncentratorer. Linjärt DNA kan skyddas från nedbrytning genom att tillsätta renat GamS-protein. Proteinnedbrytning, som är nödvändig för mer komplex kretsdynamik som svängning, kan uppnås genom att uttrycka en ClpX-hexamer i den autolysatproducerande stammen13. Slutligen aktiveras LacZ-baserade visuella avläsningar genom att använda en automatiskt använd stam som saknar lacZ. Sammantaget producerar denna metod mycket aktiv cellfri lysate som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT media</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4.85008</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0166-5G</td>
			<td>or carbenicillin, a more stable variant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>14121</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1749603</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21-Gold (DE3) &#916;lacZ carrying pAD-LyseR</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>16800</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446075</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium glutamate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1501-100G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473-25G</td>
			<td>for adjusting pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9310500GM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109541001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>United States Biosciences</td>
			<td>23160</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate

Cellfritt genuttryck erbjuder biologins kraft utan komplikationer av en levande organism. Även om många sådana genuttryckssystem finns, är de flesta ganska dyra att köpa och / eller kräver speciell utrustning och finslipad expertis för att producera effektivt. Detta protokoll beskriver en metod för att producera bakteriell cellfri lysate som stöder höga nivåer av genuttryck, använder endast standard laboratorieutrustning och kräver minimal bearbetning. Metoden använder en Escherichia coli-stam som producerar en endolysin som inte påverkar tillväxten, men som effektivt lyser en skördad cellpellet efter en enkel frys-tina cykel. Den enda ytterligare bearbetningen som krävs är en kort inkubation följt av centrifugering för att rensa autolysatet av cellulära skräp. Dynamiska genkretsar kan uppnås genom heterologt uttryck av ClpX-proteasen i cellerna före skörd. En E. coli-stam som saknar lacZ-genen kan användas för högkänsliga, cellfria bioseneringsapplikationer med hjälp av en koloretrik eller fluorescerande avläsning. Hela protokollet kräver så få som 8-9 timmar, med endast 1-2 timmars praktiskt arbete från inokulering till slutförande. Genom att minska kostnaden och tiden för att få cellfri lysat bör denna metod öka överkomliga priser på cellfria genuttryck för olika tillämpningar.

Representativa resultat kan observeras genom att använda autolysera för att uttrycka GFP från en konstituerande uttrycksplasmid, här pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, och registrera en tidsförlopp av GFP fluorescens i en plattläsare (figur 1B). En utspädningsserie av plasmid-DNA fann starka uttryck även vid 1 nM DNA. Jämfört med en kommersiellt tillgänglig lysat kan autolysatet ge en större total avkastning och uppnå en högre maximal produktionstakt, beräknad som tidsderivatet...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate at JoVE.com

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att producera bakteriell lysate för cellfria genuttryck, med hjälp av en konstruerad stam av Escherichia coli och kräver endast standard laboratorieutrustning.

Snabb, prisvärd och okomplicerad produktion av bakteriell cellfri lysate

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Med hjälp av detta protokoll kan högkvalitativa bakteriecelllystnater produceras med endast allmänt tillgänglig gemensam laboratorieutrustning, vilket gör cellfria genuttryck lättillgängliga för de flesta forskare. Genom att kombinera programcellig autolys med en frys-tina eller frystorka cykel kan skapa ett praktiskt, arbets- och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för snabb produktion av bakteriella lysater för cellfritt genuttryck. Börja med att använda en inokuleringsslinga för att strila cellerna i en autolys E.coli-stam på LB-agarplattor som innehåller 50 mikrogram per milliliter ampicillin och inkubera sedan plattorna vid 37 grader Celsius över natten.Följande dag, med hjälp av en pipettspets, plocka en enda koloni från agarplattan och tillsätt den i ett odlingsrör som innehåller LB-medium med ampicillin. Odla denna startkultur vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag tillsätt 400 mikroliter av startkulturen i en enliter Erlenmeyerkolv som innehåller 400 milliliter 2xYTPG-medium kompletterat med 50 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkubera kulturen vid 37 grader Celsius med skakning vid 300 RPM. Använd en spektrofotometer och en optisk cuvette med en centimeters banlängd och mät regelbundet kulturens optiska densitet till 600 nanometer. När den optiska densiteten överstiger en, börja späda ut kulturen femfaldigt före mätningar för att säkerställa att mätningarna förblir inom det linjära intervallet för en typisk laboratoriespektrofotometer.När den femfaldiga utspädda kulturens optiska densitet når 0,3, ta bort kolven från inkubatorn och fortsätt att förbereda lysat. För att förbereda lysat, skörda cellerna genom centrifugering vid 1 800 x g i 15 minuter vid rumstemperatur. Häll av supernatanten och ta bort den återstående vätskan med en pipett.Tillsätt 45 ml kall S30A-buffert till pelleten och återanvänd pelleten genom att virvla. Väg sedan ett tomt 50 ml centrifugrör innan du överför cellerna till röret. Centrifugera cellerna igen och kassera supernatanten.Aspirera alla återstående supernatant med hjälp av en pipett. Väg röret igen och subtrahera vikten på det tomma röret från den vikt som visas för att få pelletens vikt. För varje milligram cellpellet, tillsätt två mikroliter av kall S30A buffert kompletterad med två millimolar dithiothreitol.Resuspend sedan cellerna genom kraftig virvel. Frys sedan cellerna genom att placera dem i en negativ 20 eller negativ 80 grader Celsius frys tills pelleten är ordentligt frusen, tina sedan cellerna i ett rumstempererat vattenbad och virvla kraftigt i två till tre minuter. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 45 minuter med skakning vid 300 RPM, rensa sedan provet av tungt cellulärt skräp genom att centrifugera i genomskinliga centrifugrör vid 30 000 x g i 45 minuter vid fyra grader Celsius.Överför försiktigt supernatanten till ett nytt rör med en pipett, var försiktig så att du inte stör pelleten. Om det överförda supernatanten är förorenat med material från pelleten, upprepa centrifugeringen. Överför supernatanten till 1,5 ml centrifugrör.Och centrifugera ännu en gång vid 21 000 x g eller den maximala hastigheten för en bordscentrifuger i fem minuter. Aliquot rensa den rensade autolysate i önskade volymer och lagra på minus 80 grader Celsius tills den används. För cellfritt genuttryck som använder autolysatet, blanda åtta mikroliter autolysat och 8,9 mikroliter förblandning på is.Tillsätt DNA till en slutlig koncentration av åtta nanomol, andra nödvändiga reagenser och vatten för att erhålla en slutlig volym på 20 mikroliter. Tillsätt reaktionen på en 384-väl mikroplatta och använd en plattläsare för att mäta fluorescenstidskursen och slutpunkterna. GFP-uttryck som använder autolysatet med en utspädningsserie av plasma-DNA resulterar i starkt uttryck även med ett nanomolärt DNA.När GFP-uttrycket jämfördes mellan en kommersiellt tillgänglig lysat och autolysatet producerade det automatiskt jämförbara nivåerna av GFP. Variationen mellan partier av lysate som produceras i två olika laboratorier av olika forskare var inom ungefär tvåfaldig. De tre mest kritiska variablerna är cellpellets till buffertförhållande, överföring av skräpfritt supernatant och med optimal PEG- och magnesiumkoncentration i den slutliga reaktionen.När extraktet har förberetts kan en stor arsenal av befintliga protokoll som utvecklats för E.coli cell-fria uttryckssystem användas, såsom ClpXP-medierad nedbrytning, eller AHL-medierad kvorumavkänning.

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

Att upprätthålla Wolbachia i Cell-fri Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Analys proteasomal Nedbrytning i ett cellfritt system i växter

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

Konstruktion av en prisvärd och enkel att Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

En hybrid-DNA Extraction Metod för kvalitativ och kvantitativ bedömning av bakteriella gemenskapernas från fjäderfäproduktion Prover

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Baserat Cell yttrandefriheten System för uttryck av<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualisering och kvantifiering av cellfria lager i arterioler av Rat kremastermuskeln

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Produktion och visualisering av bakteriell Spheroplasts och Protoplasts för att karakterisera antimikrobiell peptid lokalisering

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Populations- och encellsanalys av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels (Video) | JoVE

Metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogeler på makronivå

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...