Name: development of a lateral flow immunochromatographic strip for rapid and quantitative detection of small molecule compounds
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Fundos Especiais de Fundos De Pesquisa Fundamental de instituições de ensino superior filiadas aos departamentos centrais. Agradecemos o apoio da Equipe de Pesquisa Básica de Prescrição Clássica da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Revisão ética da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (número de aprovação 2017BZYYL00120).
1. Preparação e Caracterização do Ouro Coloidal
NOTA: Para a síntese de ouro coloidal, como o ouro coloidal é facilmente adsorvido na parede interna do vaso e é propenso à precipitação por impurezas, o recipiente para síntese e armazenamento de ouro coloidal dev...

<ol>
	<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+lateral+flow+immunochromatographic+strip+with+nanoparticles+as+reporters+for+detection:+A+review.">Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).</li><li>Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune+chromatographic+assay+for+rapid+and+simultaneous+detection+of+levonorgestrel+and+methylprednisolone+in+water+samples.">An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples.</a> Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).</li><li>Lai, J. J., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+lateral-flow+immunoassay+(LFIA)+diagnostics+via+biomarker+enrichment+for+mHealth.">Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth.</a> Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).</li><li>Zhang, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colloidal+gold-based+lateral-flow+immunoassay+for+the+rapid+simultaneous+detection+of+clenbuterol+and+ractopamine+in+swine+urine.">Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine.</a> Analytical &amp; Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).</li><li>Kranthi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colloidal-gold+based+lateral-flow+immunoassay+kit+for+'quality-control'+assessment+of+pyrethroid+and+endosulfan+formulations+in+a+novel+single+strip+format.">Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format.</a> Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).</li><li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+immunochromatographic+strip+for+rapid+detection+of+capsid+protein+antigen+p27+of+avian+leukosis+virus.">Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus.</a> Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flow+immunoassay+devices+for+testing+saliva+and+other+liquid+samples+and+methods+of+use+of+same.">Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same.</a> US Patent. , (2003).</li><li>Mio&#269;evi&#263;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lateral+Flow+Assays+for+Salivary+Biomarker+Assessment:+A+Review.">Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review.</a> Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).</li><li>Lisa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+based+dipstick+immunoassay+for+the+rapid+detection+of+dichlorodiphenyltrichloroethane:+an+organochlorine+pesticide.">Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibody-Europium+Conjugate-Based+Lateral+Flow+Time-Resolved+Fluoroimmunoassay+for+Quantitative+Determination+of+T-2+Toxin+in+Cereals+and+Feed.">Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed.</a> Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+synthesis+of+high-quality+CuInZnxS2+x+core/shell+nanocrystals+and+their+application+for+detection+of+C-reactive+protein.">Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein.</a> Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).</li><li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+double+antibody+sandwich-lateral+flow+immunoassay+for+the+rapid+and+simple+detection+of+hepatitis+C+virus.">A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+immunochromatography+test+strip+for+rapid,+quantitative+and+sensitive+detection+of+alpha+fetoprotein.">Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).</li><li>Song, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fluorescent+lateral-flow+immunoassay+for+hepatitis+B+virus+genotyping.">Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping.</a> Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies.">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+GsRerarin.">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Clinical+Application+of+a+Rapid+IgM-IgG+Combined+Antibody+Test+for+SARS-CoV-2+Infection+Diagnosis.">Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).</li><li>Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+application+value+analysis+of+the+2019-coronary+virus+disease+was+analyzed+by+the+whole+blood+Sars-COV+2+specific+antibody+detection.">The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection.</a> Natural Science Edition. 42, (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Monoclonal+Antibodies+Against+Natural+Products.">Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products.</a> Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).</li><li>Sai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+and+Immunoaffinity+Column+Chromatography+for+Saikosaponin+d+Using+an+Anti-Saikosaponin+d+Monoclonal+Antibody.">Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody.</a> Planta Medica. 82, 432-439 (2016).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+Immunochromatographic+Strip+Test+for+Rapid+and+Quantitative+Detection+of+Saikosaponin+d.">A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d.</a> Molecules. 23 (2), 338 (2018).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+Puerarin.">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies.">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li></ol>

Neste trabalho, apresentamos um protocolo para a preparação de mAbs contra pequenas moléculas derivadas de produtos naturais. As etapas essenciais e as questões que necessitam de atenção no procedimento foram delineadas, e demonstramos a utilidade deste protocolo usando como exemplo a pequena molécula SSD. Exemplos de espectros, imagens TEM, resultados quantitativos e investigações metodológicas são mostrados em dados representativos. Assim, demonstramos que a produção de ouro coloidal, a conjugação AuNP-m...

As tiras imunocromatográficas de fluxo lateral baseadas em membrana (ICSs) são ferramentas úteis para detecção rápida e de baixo custo. A membrana de nitrocelulose como o portador e o ouro coloidal como marcadores de reagentes de diagnóstico rápido de cromatografia imune são o método POCT (teste de ponto de cuidado) mais usado, e o escopo de teste do projeto é mais amplo. A partir de sua aplicação original no monitoramento durante a gravidez, seu uso foi estendido para monitorar o estado de coagulação sanguínea1,2, lesão do miocárdio3, medicina veterinária4, resíduos de pesticidas5,doenças infecciosas6 e concentrações de medicamentos. Mais tipos de amostras podem ser avaliadas, incluindo urina, saliva, sangue inteiro, soro e outros fluidos corporais7,8,9.
Nos últimos anos, inúmeros novos ensaios foram desenvolvidos para detectar biomarcadores no diagnóstico de transtornos, incluindo HPLC, UPLC, LC-MS e ELISA, sensíveis e precisos, críveis e específicos. No entanto, esses métodos requerem instrumentação sofisticada, pré-processamento complexo e tratamentos demorados9. Assim, desenvolver uma estratégia de diagnóstico de ponto de cuidado mais rápida e conveniente para a detecção auto e em tempo real de compostos ativos medicinais é urgente10,11.
A popularidade dos ICSs, especialmente para testes comuns, é impulsionada pela facilidade de uso, pois não necessitam de profissionais ou configurações instrumentais elaboradas12. Em outras palavras, pessoas que não possuem treinamento especial podem operar tiras ou autotestes13. Os resultados do teste podem ser obtidos em 5 minutos, o que significa que pode ser usado para inspeções no local14. Além disso, de acordo com nossos cálculos, o custo das tiras poderia ser inferior a 1 RMB15,o que significa que os testes são baratos para promover16. Portanto, o ICS é um dispositivo descartável relativamente preciso, simples e barato. ICSs baseados em ouro coloidal17,18 também são aplicados na detecção rápida covid-19.
O princípio do ICS pode ser dividido em sanduíche ICS e ICS competitivo. Figura 1A é um diagrama esquemático do sanduíche ICS, que é usado principalmente para detectar substâncias macromoleculares como proteínas, incluindo marcadores tumorais, fatores inflamatórios e gonadotropina coriônica humana (HCG, antígeno da gravidez precoce). Neste método, anticorpos emparelhados direcionados a diferentes epítopos do antígeno são usados, e o anticorpo de captura é seco na membrana NC como uma linha de teste. O anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada, e o anticorpo secundário é usado como linha de controle.
Figura 1B é um diagrama esquemático do ICS competitivo, que é usado principalmente para detectar pequenas substâncias moléculas (MWCO < 2000 Da). O antígeno de revestimento é fixado na membrana NC como uma linha de teste, e o anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada. Durante a detecção, a amostra e o fluxo de anticorpos rotulados através da linha de detecção sob ação capilar, e o antígeno revestido liga competitivamente o antígeno livre na amostra e desenvolve uma cor vermelha na linha de detecção.
Recentemente, descrevemos o procedimento de geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais19. Neste trabalho, desenvolvemos um novo imunoensaio de fluxo lateral baseado no preparado anti-SSD mA20 para detecção rápida e no local. Os resultados indicam que o ensaio de imunocromatografia é uma ferramenta indispensável e conveniente para detectar compostos derivados de produtos naturais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62754/62754fig01.jpg"> Figura 1 Diagrama esquemático do ensaio de imunocromatografia (A) Tiras de teste imunocromatomatográficas sanduíche. (B) Tiras de teste anti-cromatográficas imunes competitivas indiretas. Este número foi modificado a partir de Zhang et al., 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62754/62754fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroauric acid solution (HAuCl4)</td>
			<td>Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory</td>
			<td>JY-SJ102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates, 96 well</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>H5072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass fibre membranes</td>
			<td>Jieyi</td>
			<td>XQ-Y6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>applygen</td>
			<td>C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>millipore 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Beijing BIODEE</td>
			<td>5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG20000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 10mL</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 25mL</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semi-rigid PVC sheets</td>
			<td>Jieyi</td>
			<td>JY-C104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td>C1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodate</td>
			<td>Sinopharm Chemical</td>
			<td>BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-GMBS</td>
			<td>Perbio Science Germany</td>
			<td>22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a lateral flow immunochromatographic strip for rapid and quantitative detection of small molecule compounds

As tiras imunocromatográficas de fluxo lateral baseadas em membrana (ICSs) são ferramentas úteis para o autodiagnóstico de baixo custo e têm sido aplicadas eficientemente à toxina, ao índice fisiológico e à detecção de biomarcadores clínicos. Neste protocolo, fornecemos uma descrição detalhada das etapas para desenvolver um imunoensaio de fluxo lateral rápido, sensível e quantitativo (usando AuNPs como marcador e mAbs como uma sonda). O procedimento descreve a preparação e caracterização do ouro coloidal, síntese do conjugado AuNP-mAb, montagem da tira imunocromatográfica e investigação metodológica do ensaio. Os resultados mostraram que as tiras finais podem ser ainda mais utilizadas para o rápido e conveniente autodiagnóstico de uma pequena molécula, o que pode fornecer uma ferramenta alternativa na análise rápida e precisa dos índices fisiológicos e biológicos.

Caracterização do ouro coloidal As soluções de ouro coloidal preparadas eram vermelho claret. Foram utilizadas análises tem para determinar a morfologia e a forma de AuNPs (Figura 2A-D). A Figura 2A e a Figura 2B revelam que as partículas são poliédricas em forma e uniformemente distribuídas. O diâmetro médio dos AuNPs foi encontrado em aproximadamente 14 nm (Figur...

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Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

O procedimento descreve a preparação do ouro coloidal e a montagem das tiras imunocromatográficas. Em primeiro lugar, o ácido cloroauúrico e citrato de sódio foram usados para a síntese de ouro coloidal. O citrato de sódio foi adicionado à solução de ácido cloroaurico e fervido para obter ouro coloidal com tamanho de partícula adequado.Síntese, o anticorpo de ouro coloidal conjugado. Após a centrifugação, partículas de ouro coloidais foram dissolvidas em solução apropriada e, em seguida, resuspended para obter solução de ouro coloidal. Submergir a membrana de fibra de vidro na conjugação para preparar a almofada conjugada.Solte antígeno artificial e anticorpos secundários na membrana NC como linha T e linha C. Conecte a membrana NC, a membrana absorvente, a amostragem e a membrana de fibra de vidro na placa de PVC, respectivamente. Corte a placa de papel montada em uma tira de 3,5 milímetros de largura.Confect full percent gold cloreto solução e 1% solução de citrato de sódio, respectivamente. Ligue o agitador magnético e coloque o frasco em uma batedeira. Adicione 120 mililitros destilados água em um frasco de fundo redondo e aqueça-a para ferver em um agitador magnético termostático.Mantenha a ebulição e adicione rapidamente 0,5 mililitros de ácido cloroaurico completo e cinco mililitros de 1% de citrato de sódio. Continue aquecendo por 5 a 10 minutos. Observe a cor da solução mudando de amarelo pálido para tinto vinho.Desligue a potência da batedeira magnética termostática, esfrie até a temperatura ambiente e coloque a mistura em uma garrafa limpa. Armazene a quatro centígradas. As nanopartículas de ouro mostram o efeito Tyndall.O tamanho e a morfologia das nanopartículas de ouro foram determinados pela espectroscopia ultravioleta e pela imagem do microscópio eletrônico de transmissão. Adicione 100 microliters solução de cloreto de sódio a oito tubos. Ajuste as soluções de ouro coloidal para pH 5 a 12 usando 0,1 mol por litro de carbonato de potássio.Adicione 100 microliters de solução de ouro coloidal a oito tubos contendo cloreto de sódio. Fique para o poste vários minutos após a mistura. Observe a mudança de cor de cada solução de tubo e regise o tubo que permanece vermelho.Escolha o valor do pH com a menor quantidade de carbonato de potássio adicionado e uma cor de solução estável como o valor ideal de pH para preparar conjugado. Adaptou a mesma abordagem. Observei a mudança de cor e grave o tubo que permanece vermelho.Escolha a quantidade de anticorpos com a menor concentração de mAB e uma cor de solução estável como a quantidade mAB ideal. Pegue 10 mililitros de solução de ouro coloidal e use 0,1 mol por litro de carbonato de potássio para ajustar a solução ao valor ideal de pH. Adicione lentamente os SSd mABs com a concentração apropriada e agite à temperatura ambiente por 30 minutos.Centrifugar a mistura a 2000 RPM por 20 minutos a quatro centígradas. Remova o precipitado contendo impurezas do ouro coloidal precipitado. Centrifugar a mistura a 10.000 RPM por 40 minutos.Descarte o supernatante. O precipitado é conjugado de ouro coloidal mAB. Adicione ácido clorídrico Tris, BSA, Tween 20 e PEG 20.000, em seguida, misture bem para preparar o tampão de resuspensão.Adicione o tampão de resuspensão e dissociar o precipitado. A tira do material da membrana, incluindo membrana de celulose de vidro, membrana de celulose de poliéster e placa de PVC. O material da membrana, precisa rastrear e avaliar por microscópio estéril para se livrar da inhomogeneidade.Primeiro, coloque a membrana NC na placa de PVC a dois centímetros da borda da extremidade da seção da placa. Em segundo lugar, solte dois miligramas por mililitro SSd-BSA na membrana NC a dois centímetros da borda superior como linha de teste e solte 1,5 miligramas por IgG anti-rato de ouro mililitro na membrana NC a dois centímetros da borda inferior como linha de controle. Conecte a almofada absorvente à folha de PVC acima da membrana NC e sobreponha-se à membrana NC por dois milímetros.Corte a membrana de fibra de vidro para cinco centímetros de comprimento e dois centímetros de largura e use como uma almofada conjugada. Submergir a membrana de fibra de vidro na solução conjugada de nanopartículas de ouro mAB. Mergulhe por um tempo para fazer as nanopartículas de ouro mAB absorção.Seque a membrana larga na incubadora a 37 graus. Cole a almofada conjugada pré-tratada sob a membrana NC e o comprimento sobreposto com a membrana NC deve ser de 0,1 centímetros. Corte a membrana Fusion3 em 1,8 centímetros de comprimento e 3,5 centímetros de largura e use como almofada de amostra.Em seguida, coloque a almofada de amostra na placa de PVC e sobreponha-se com a almofada conjugada por dois milímetros. Corte, monte a placa de papel em tiras de largura de 3,5 milímetros usando uma máquina de corte e compacta usando um sistema de laminação em lote. Finalmente, coloque as tiras de teste na concha.Sele-os em um saco de papel alumínio contendo dessecante e a loja longe da luz. O ICS está agora montado. Solte 50 microliters de solução amostral no orifício da amostra para observar o processo de cromatografia.Em seguida, analise as tiras usando um leitor de tiras portátil. A máquina pode fornecer a razão da linha de teste para a linha de controle. Avalie a especificidade, sensibilidade, repetibilidade e estabilidade do teste ics.As soluções de ouro coloidal preparadas foram lidas. Análises de microscópio eletrônico de transmissão revelaram que as partículas tinham forma poliédrica e foram uniformemente distribuídas com um diâmetro médio de 14 nanômetros. Imagens de microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução mostraram um padrão de franja contínua com um espaçamento de 0,117 nanômetros de nanopartículas de ouro.A absorção visível ultravioleta indicou que diferentes tamanhos de partículas de ouro coloidal podem ser obtidos alterando a proporção de sódio citrato e ácido cloroaurico. No experimento quantitativo, as tiras com os resultados dos testes de saikosaponin D foram digitalizadas usando um leitor portátil de ICS. Calculamos uma curva padrão relacionando não-concentrações de saikosaponina D à absorção correspondente em cada concentração.Após investigação metodológica, o método pode ser aplicado para detecção quantitativa e semi-qualitativa de compostos de pequenas moléculas. Este procedimento inclui a preparação de ouro coloidal, síntese de nanopartículas de ouro mAB conjugado, montagem da tira e investigação metodológica. Este trabalho fornece um protocolo detalhado para o desenvolvimento de tira imunocromatográfica para uso na detecção rápida e quantitativa de pequenas moléculas.Depois de assistir a este vídeo espero que você tenha um bom entendimento para a preparação da tira imunocromatográfica. Obrigado por assistir e boa sorte para suas experiências.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Agarose reticulada ativada para o rápido desenvolvimento de resinas de cromatografia de afinidade-captura de anticorpos como um estudo de caso

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...