Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Wij danken Miriam Bünning voor de technische ondersteuning. We erkennen de steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 aan A.P.), Spark en Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), de United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) en het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (e: Bio jonge onderzoeker subsidie AZ 031L0211 aan A.P.). Het werk in het laboratorium van C.R.R. werd ondersteund door de DFG (FOR 2795 "Synapsen under stress", Ro 2327/13-1).

OPMERKING: Voor het gebruik van menselijke iPSC's kan een ethische goedkeuring vereist zijn. iPSC's die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van gezonde controlepersonen na lokale ethische goedkeuring (# 2019-681). Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd onder een steriele celkweekkap, waarbij alle reagentia en verbruiksartikelen zorgvuldig worden gedesinfecteerd voordat ze onder de motorkap worden overgebracht. Menselijke iPSC's die voor differentiatie worden gebruikt, moeten een passagegetal hebben ...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Dit artikel beschrijft de reproduceerbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik voor mitochondriale ziektemodellering. Het hier beschreven protocol is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd werk20. Een groot voordeel van het huidige protocol is dat het niet vereist dat elke organoïde handmatig in een steigermatrix wordt ingesloten. In feite wordt de matrixoplossing eenvoudig opgelost in het celkweekmedium. Bovendien is het niet nodig om dure bioreactoren...

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme1. Ze worden veroorzaakt door genetische mutaties die verschillende mitochondriale processen verstoren, waaronder oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2, ademhalingsketenassemblage, mitochondriale dynamica en mitochondriale DNA-transcriptie of -replicatie3. Weefsels met energiebehoeften worden in het bijzonder beïnvloed door mitochondriale disfunctie4. Dienovereenkomstig ontwikkelen patiënten met mitochondriale ziekten meestal neurologische manifestaties met vroege aanvang.
Er zijn momenteel geen behandelingen beschikbaar voor kinderen met mitochondriale ziekten5. Een belangrijke belemmering voor de ontwikkeling van mitochondriale ziekten door geneesmiddelen is het gebrek aan effectieve modellen die het verloop van de menselijke ziekte samenvatten6. Verschillende van de momenteel bestudeerde diermodellen vertonen niet de neurologische defecten die bij de patiënten aanwezig zijn7. Vandaar dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten nog steeds niet volledig worden begrepen.
Recente studies genereerden iPSC's van patiënten met mitochondriale ziekten en gebruikten deze cellen om patiëntspecifieke neuronale cellen te verkrijgen. Genetische defecten geassocieerd met de mitochondriale ziekte, het syndroom van Leigh, blijken bijvoorbeeld afwijkingen te veroorzaken in cellulaire bio-energetica8,9, eiwitsynthese10 en calciumhomeostase9,11. Deze rapporten gaven belangrijke mechanistische aanwijzingen over de neuronale stoornis die optreedt bij mitochondriale ziekten, waardoor de weg werd vrijgemaakt voor de ontdekking van geneesmiddelen voor deze ongeneeslijke ziekten12.
Tweedimensionale (2D) culturen maken het echter niet mogelijk om de architecturale complexiteit en regionale organisatie van 3D-organen te onderzoeken13. Hiertoe kan het gebruik van 3D-hersenorganoïden afgeleid van patiëntspecifieke iPSCs14 onderzoekers in staat stellen aanvullende belangrijke informatie te verkrijgen en daardoor te helpen ontleden hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel beïnvloeden15. Studies met iPSC-afgeleide hersenorganoïden om mitochondriale ziekten te onderzoeken, beginnen de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten te ontdekken. 
Ruggenmergorganoïden met mutaties geassocieerd met de mitochondriale ziekte, mitochondriale encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes syndroom (MELAS), vertoonden defecte neurogenese en vertraagde differentiatie van motorneuronen16. Corticale organoïden afgeleid van patiënten met de mitochondriale ziekte, Leigh-syndroom, vertoonden verminderde omvang, defecten in neurale epitheliale knopgeneratie en verlies van corticale architectuur17. Hersenorganoïden van patiënten met het Leigh-syndroom toonden aan dat de ziektedefecten initiëren op het niveau van neurale voorlopercellen, die zich niet kunnen binden aan mitochondriaal metabolisme, waardoor afwijkende neuronale vertakkingen en morfogenese18 ontstaan. Neurale voorlopers kunnen dus een cellulair therapeutisch doelwit vormen voor mitochondriale ziekten, en strategieën die hun mitochondriale functie bevorderen, kunnen de functionele ontwikkeling van het zenuwstelsel ondersteunen.
Het gebruik van hersenorganoïden kan helpen bij het blootleggen van de neurologische ontwikkelingscomponenten van mitochondriale ziekten. Mitochondriale ziekten worden voornamelijk beschouwd als neurodegeneratie met vroege aanvang5. Neurologische ontwikkelingsstoornissen zijn echter ook aanwezig bij patiënten die worden getroffen door mitochondriale ziekten, waaronder ontwikkelingsachterstand en cognitieve stoornissen19. Patiëntspecifieke hersenorganoïden kunnen helpen deze aspecten aan te pakken en op te helderen hoe mitochondriale ziekten de ontwikkeling van de menselijke hersenen kunnen beïnvloeden. Mitochondriale disfunctie kan ook een pathogenetische rol spelen bij andere, meer voorkomende neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington4. Vandaar dat het ophelderen van de impact van mitochondriale defecten in de neurologische ontwikkeling met behulp van hersenorganoïden ook instrumenteel kan zijn voor de studie van die ziekten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden die kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van ziektemodellering van mitochondriale ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

Mitochondriale ziekten vertegenwoordigen de grootste klasse van aangeboren fouten van het metabolisme en zijn momenteel ongeneeslijk. Deze ziekten veroorzaken neurologische ontwikkelingsdefecten waarvan de onderliggende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Een belangrijke wegversperring is het gebrek aan effectieve modellen die de neuronale stoornis met vroege aanvang bij de patiënten samenvatten. Vooruitgang in de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maakt het mogelijk om driedimensionale (3D) hersenorganoïden te genereren die kunnen worden gebruikt om de impact van ziekten op de ontwikkeling en organisatie van het zenuwstelsel te onderzoeken. Onderzoekers, waaronder deze auteurs, hebben onlangs menselijke hersenorganoïden geïntroduceerd om mitochondriale aandoeningen te modelleren. Dit artikel rapporteert een gedetailleerd protocol voor de robuuste generatie van menselijke iPSC-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik in mitochondriale bio-energetische profilering en beeldvormingsanalyses. Deze experimenten zullen het gebruik van hersenorganoïden mogelijk maken om metabole en ontwikkelingsstoornissen te onderzoeken en kunnen cruciale informatie opleveren om de neuronale pathologie van mitochondriale ziekten te ontleden.

Het hier beschreven protocol vergemakkelijkt de robuuste generatie van ronde organoïden (figuur 1A). De gegenereerde organoïden bevatten volwassen neuronen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van eiwitmarkers die specifiek zijn voor axonen (SMI312) en dendrieten (microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2)) (Figuur 1B). Volwassen organoïden bevatten niet alleen neuronale cellen (MAP2-positief), maar ook g...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Dit protocol heeft tot doel hersenorganoïden te gebruiken om mitochondriale ziekten te bestuderen. Het is ontwikkeld voor het genereren van reproduceerbare hersenorganoïden bij de beoordeling van hun mitochondriale eigenschappen. Deze methode vereist geen dure bioreactoren en tijdrovende inbeddingsprocedures.Daarom is het eenvoudig te implementeren en op te schalen. Dit protocol maakt het mogelijk om reproduceerbare hersenorganoïden te genereren en hun mitochondriale eigenschappen te testen. Dit kan leiden tot de identificatie van interventionele doelen voor onbehandelbare mitochondriale ziekten.Kweek om te beginnen menselijke iPSC's onder feedervrije omstandigheden in iPSC-medium op gecoate platen met zes putten en bewaar ze in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Passeer de iPSC's bij 80% confluentie met behulp van enzymvrij loslatingsmedium in verhoudingen variërend van één bij vier tot één bij 12. Om de celoverleving te verhogen, voegt u na elke splitsing 10 micromolaire rho-geassocieerde eiwitkinase of ROCK-remmer toe.Dissociëer de 80% iPSC's op dag nul. Bereid corticale differentiatie medium één of CDM1 voor en verwarm het voor bij kamertemperatuur voordat u het aan de cellen toevoegt. Was de putjes met de iPSC's met PBS om dode cellen en vuil te verwijderen.Voeg 500 microliter voorverwarmd reagens A toe aan elke put en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer onder de microscoop om celloslating te garanderen. Voeg één milliliter iPSC-medium toe aan het verdunningsreagens A om de activiteit ervan te neutraliseren.Gebruik een pipet van 1.000 microliter om de cellen te dissociëren door op en neer te leidingen en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer de iPSC's voorzichtig op 125 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op om te voorkomen dat de celkorrel wordt verstoord. Resuspend de pellet met één milliliter CDM1 om een enkele celsuspensie te verkrijgen en het celnummer te tellen.Bereid het zaaimedium met 9.000 iPSC's per 100 microliter in CDM1 aangevuld met 20 micromolaire ROCK-remmer, drie micromolaire WNT-catenineremmer of IWR-1 en vijf micromolaire SB-431542. Voeg 100 microliter zaaimedium per put toe aan een 96-well V bodemplaat. Bewaar de plaat in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Om neurosferen te genereren, observeer op de eerste dag dat ronde celaggregaten met gedefinieerde gladde randen zich vormen. Let op de dode cellen rond de aggregaten. Blijf kweken in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Op dag drie roert u de plaat door drie keer op de zijkanten te tikken om dode cellen los te maken en voegt u vervolgens 100 microliter CDM1 aangevuld met 20 micromolaire ROCK-remmer, drie micromolaire IWR-1 en vijf micromolaire SB-431542 toe aan elke put. Houd de plaat bij de couveuse op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder op dag zes voorzichtig 80 microliter van het supernatant medium uit elke put.Vermijd het aanraken van de bodem van de put. Voeg 100 microliter CDM1 aangevuld met drie micromolaire IWR-1 en vijf micromolaire SB-431542 toe aan elke put en incubeer de plaat. Herhaal de vorige stap na elke drie dagen tot dag 18.Op dag 18, om neurosferen over te brengen, bereidt u CDM2 voor en voegt u 10 milliliter toe aan een 100 millimeter ultralaag aanhechtingscelkweekplaat. Gebruik een pipet van 200 microliter waarvan de punt is afgesneden om de ronde neurosferen van de 96-well plaat over te brengen naar de 100 millimeter ultra low attachment cell culture plate. Verwijder vijf milliliter medium van de plaat met de neurosferen en voeg vijf milliliter verse CDM2 toe.Plaats de plaat op een orbitale shaker met 70 omwentelingen per minuut in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Aspirateer het supernatant medium om de drie dagen zorgvuldig en vervang het door verse CDM2. Laat een kleine hoeveelheid van het medium achter om te voorkomen dat neurosferen uitdrogen.Bereid op dag 35 CDM3 voor. Zuig het medium uit de plaat en voeg 10 milliliter koude CDM3 toe. Plaats na het verwisselen van het medium de plaat terug op een orbitale shaker met 70 rotaties per minuut in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Verander het medium om de drie tot vijf dagen, afhankelijk van de groeisnelheid zoals aangegeven door de kleur van het medium. Bereid op dag 70 CDM4 voor. Gebruik CDM4 medium totdat de gewenste leeftijd van organoïden is bereikt.Houd de plaat gedurende deze periode op een orbitale shaker met 70 rotaties per minuut in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verander het medium om de drie tot vijf dagen, afhankelijk van de groeisnelheid. Bereid 4%PFA-oplossing voor en plaats deze onder een veiligheidskap.Verzamel hersenorganoïden en breng ze voorzichtig over met een stompe plastic Pasteur-pipet van drie milliliter naar een plaat met zes putten gevuld met PFA. Bewaar de organoïden gedurende één uur bij kamertemperatuur in de PFA-oplossing. Verwijder de PFA voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet van drie milliliter en was de vaste organoïden drie keer met PBS.Bewaar de vaste organoïden bij vier graden Celsius in PBS tot verder gebruik. De organoïden die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, bevatten volwassen neuronen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van eiwitmarkers die specifiek zijn voor axonen en dendrieten. Volwassen organoïden bevatten niet alleen neuronale cellen, maar ook gliacellen.Met behulp van gesneden hersenorganoïdenanalyse is het mogelijk om SMI 312-positieve axonen en MAP2-positieve dendrieten of de S100 bèta-gliacellen te controleren. Verder helpen confocale beelden om de gedetailleerde distributie en organisatie van SOX2-positieve neurale voorlopers te onderzoeken met betrekking tot bèta-3 tubulinepositieve neuronen. Hersenorganoïden werden gekleurd voor mitochondria-specifieke markers, zoals translocase van het buitenmembraan of TOM20.Bio-energetische profilering van hersenorganoïden werd uitgevoerd door zowel mitochondriaal metabolisme te meten met behulp van de zuurstofconsumptiesnelheid, of OCR, als het glycolytische metabolisme met behulp van de extracellulaire verzuringssnelheid of ECAR. Oligomycine veroorzaakt een daling van het OCR-profiel en identificeert daarom de OCR die nodig is voor ATP-productie. Bij behandeling met oligomycine kan er ook een compenserende toename van ECAR zijn, wat suggereert dat de cellen glycolyse kunnen upreguleren om de metabole stress te voorkomen.Bij het overbrengen van de neurosferen van de 96-putplaat naar een kweekplaat of tijdens de bevestigingsprocedure, is het cruciaal om de organoïden voorzichtig te hanteren om beschadiging ervan te voorkomen. Na het genereren van hersenorganoïden zouden multi-elektrode array of calciumbeeldvorming ideale methoden zijn om de functionaliteit van de organoïden te testen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Voorbereiding van oligomere β-amyloïde 1-42 En Inductie van synaptische plasticiteit Waardevermindering op hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Driedimensionale vorm modellering en analyse van Hersenstructuren

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Generatie van menselijke motorische eenheden met functionele neuromusculaire juncties in microfluïdische apparaten

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...