Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Nous remercions Miriam Bünning pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 à A.P.), de Spark et de l’Institut de la santé de Berlin (BIH) (FONDS DE VALIDATION DE LA BOSNIE-HERZÉGOVINE à A.P.), de la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), de l’hôpital universitaire de Düsseldorf (Forschungskommission UKD à A.P.) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) (e: Subvention bio jeune chercheur AZ 031L0211 à A.P.). Les travaux en laboratoire du C.R.R. ont été soutenus par la DFG (FOR 2795 « Synapses sous stress », Ro 2327/13-1).

REMARQUE: L’utilisation de CSPi humaines peut nécessiter une approbation éthique. Les CSPi utilisées dans cette étude ont été dérivées de personnes témoins en bonne santé après approbation éthique locale (#2019-681). Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire stérile, en désinfectant soigneusement tous les réactifs et consommables avant de les transférer sous le capot. Les CSPi humaines utilisées pour la différenciation devraient avoir u...

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	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Cet article décrit la génération reproductible d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation pour la modélisation des maladies mitochondriales. Le protocole décrit ici est modifié sur la base d’un travail précédemment publié20. Un avantage majeur du protocole actuel est qu’il ne nécessite pas l’intégration manuelle de chaque organoïde dans une matrice d’échafaudage. En fait, la solution matricielle est simplement dissoute dans le milieu de cultu...

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme1. Ils sont causés par des mutations génétiques perturbant différents processus mitochondriaux, y compris la phosphorylation oxydative (OXPHOS)2, l’assemblage de la chaîne respiratoire, la dynamique mitochondriale et la transcription ou la réplication de l’ADN mitochondrial3. Les tissus ayant des besoins énergétiques sont particulièrement affectés par le dysfonctionnement mitochondrial4. En conséquence, les patients atteints de maladies mitochondriales développent généralement des manifestations neurologiques précoces.
Il n’existe actuellement aucun traitement disponible pour les enfants atteints de maladies mitochondriales5. Un obstacle majeur au développement de médicaments pour les maladies mitochondriales est le manque de modèles efficaces récapitulant l’évolution de la maladie humaine6. Plusieurs des modèles animaux actuellement étudiés ne présentent pas les défauts neurologiques présents chez les patients7. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à la pathologie neuronale des maladies mitochondriales ne sont toujours pas entièrement compris.
Des études récentes ont généré des CSPi de patients atteints de maladies mitochondriales et ont utilisé ces cellules pour obtenir des cellules neuronales spécifiques au patient. Par exemple, des défauts génétiques associés à la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, se sont avérés causer des aberrations dans la bioénergétique cellulaire8,9, la synthèse des protéines10 et l’homéostasie du calcium9,11. Ces rapports ont fourni d’importants indices mécanistes sur la déficience neuronale survenant dans les maladies mitochondriales, ouvrant la voie à la découverte de médicaments pour ces maladies incurables12.
Les cultures bidimensionnelles (2D), cependant, ne permettent pas d’étudier la complexité architecturale et l’organisation régionale des orgues 3D13. À cette fin, l’utilisation d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC spécifiques au patient14 peut permettre aux chercheurs d’obtenir des informations supplémentaires importantes et ainsi aider à disséquer l’impact des maladies mitochondriales sur le développement et la fonction du système nerveux15. Des études utilisant des organoïdes cérébraux dérivés de l’iPSC pour étudier les maladies mitochondriales commencent à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales. 
Les organoïdes de la moelle épinière porteurs de mutations associées à la maladie mitochondriale, à l’encéphalopathie mitochondriale, à l’acidose lactique et au syndrome des épisodes ressemblant à des accidents vasculaires cérébraux (MELAS) ont montré une neurogenèse défectueuse et une différenciation retardée des motoneurones16. Les organoïdes corticaux dérivés de patients atteints de la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, ont montré une taille réduite, des défauts dans la génération de bourgeons épithéliaux neuronaux et une perte de l’architecture corticale17. Les organoïdes cérébraux de patients atteints du syndrome de Leigh ont montré que les défauts de la maladie s’initient au niveau des cellules progénitrices neurales, qui ne peuvent pas s’engager dans le métabolisme mitochondrial, provoquant une ramification neuronale aberrante et une morphogenèse18. Ainsi, les progéniteurs neuronaux peuvent représenter une cible thérapeutique cellulaire pour les maladies mitochondriales, et les stratégies favorisant leur fonction mitochondriale peuvent soutenir le développement fonctionnel du système nerveux.
L’utilisation d’organoïdes cérébraux pourrait aider à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales. Les maladies mitochondriales sont principalement considérées comme une neurodégénérescence précoce5. Cependant, des défauts neurodéveloppementaux sont également présents chez les patients atteints de maladies mitochondriales, notamment un retard de développement et des troubles cognitifs19. Les organoïdes cérébraux spécifiques au patient peuvent aider à traiter ces aspects et à élucider comment les maladies mitochondriales peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau humain. Le dysfonctionnement mitochondrial pourrait également jouer un rôle pathogénétique dans d’autres maladies neurologiques plus courantes, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington4. Par conséquent, élucider l’impact des défauts mitochondriaux dans le développement neurologique à l’aide d’organoïdes cérébraux pourrait également être déterminant pour l’étude de ces maladies. Cet article décrit un protocole détaillé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles qui peuvent être utilisés pour effectuer la modélisation des maladies mitochondriales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme et sont actuellement incurables. Ces maladies provoquent des anomalies neurodéveloppementales dont les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Un obstacle majeur est le manque de modèles efficaces récapitulant la déficience neuronale précoce observée chez les patients. Les progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération d’organoïdes cérébraux tridimensionnels (3D) qui peuvent être utilisés pour étudier l’impact des maladies sur le développement et l’organisation du système nerveux. Les chercheurs, y compris ces auteurs, ont récemment introduit des organoïdes cérébraux humains pour modéliser les troubles mitochondriaux. Cet article présente un protocole détaillé pour la génération robuste d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation dans le profilage bioénergétique mitochondrial et les analyses d’imagerie. Ces expériences permettront l’utilisation d’organoïdes cérébraux pour étudier les dysfonctionnements métaboliques et développementaux et peuvent fournir des informations cruciales pour disséquer la pathologie neuronale des maladies mitochondriales.

Le protocole décrit ici facilite la génération robuste d’organoïdes ronds (Figure 1A). Les organoïdes générés contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones (SMI312) et aux dendrites (protéine 2 associée aux microtubules (MAP2)) (Figure 1B).. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales (MAP2-pos...

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Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Ce protocole vise à utiliser des organoïdes cérébraux pour étudier les maladies mitochondriales. Il a été développé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles dans l’évaluation de leurs propriétés mitochondriales. Cette méthode ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux et de procédures d’intégration fastidieuses.Par conséquent, il est facile à mettre en œuvre et à mettre à l’échelle. Ce protocole permet de générer des organoïdes cérébraux reproductibles et de tester leurs propriétés mitochondriales. Cela peut conduire à l’identification de cibles interventionnelles pour les maladies mitochondriales incurables.Pour commencer, cultivez des CSPi humaines dans des conditions sans mangeoire dans un milieu iPSC sur des plaques revêtues de six puits et conservez-les dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Passage des CSPi à 80% de confluence en utilisant un milieu de détachement sans enzyme dans des rapports allant de un par quatre à un par 12. Pour augmenter la survie cellulaire, ajoutez 10 micromolaires rho-associated protein kinase ou inhibiteur de ROCK après chaque fractionnement.Dissocier les 80% iPSC au jour zéro. Préparez le milieu de différenciation corticale un ou CDM1 et préchauffez-le à température ambiante avant de l’ajouter aux cellules. Lavez les puits contenant les CSPi avec du PBS pour éliminer les cellules mortes et les débris.Ajouter 500 microlitres de réactif A préchauffé à chaque puits et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez au microscope pour vous assurer du détachement des cellules. Ajouter un millilitre de milieu iPSC pour diluer le réactif A afin de neutraliser son activité.Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour dissocier les cellules en les canalisant de haut en bas et transférez la suspension de la cellule dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Centrifugez doucement les cSPi à 125 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirez soigneusement le surnageant pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Remettez en suspension la pastille avec un millilitre de CDM1 pour obtenir une suspension à cellule unique et compter le nombre de cellules.Préparer le milieu d’ensemencement avec 9 000 cSPi pour 100 microlitres dans le MDP1 complété par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois inhibiteurs micromolaires de la caténine WNT ou IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542. Ajouter 100 microlitres de milieu d’ensemencement par puits à une plaque inférieure de 96 puits en V. Conservez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.Pour générer des neurosphères, le premier jour, observez que des agrégats de cellules rondes avec des bordures lisses définies se forment. Notez les cellules mortes autour des agrégats. Continuer à cultiver dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le troisième jour, agitez la plaque en tapotant sur les côtés trois fois pour détacher les cellules mortes, puis ajoutez 100 microlitres de CDM1 complétés par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits. Gardez la plaque à l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le sixième jour, retirez soigneusement 80 microlitres du milieu surnageant de chaque puits.Évitez de toucher le fond du puits. Ajouter 100 microlitres de CDM1 complétés par trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits et incuber la plaque. Répétez l’étape précédente tous les trois jours jusqu’au jour 18.Le jour 18, pour transférer des neurosphères, préparez le CDM2 et ajoutez 10 millilitres à une plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Utilisez une pipette de 200 microlitres avec la pointe coupée pour transférer les neurosphères rondes de la plaque de 96 puits à la plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Retirer cinq millilitres de milieu de la plaque contenant les neurosphères et ajouter cinq millilitres de CDM2 frais.Placez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Tous les trois jours, aspirez soigneusement le milieu surnageant et remplacez-le par du CDM2 frais. Laissez une petite quantité du milieu pour empêcher les neurosphères de se dessécher.Le jour 35, préparez le MDP3. Aspirer le milieu de la plaque et ajouter 10 millilitres de CDM3 froid. Après avoir changé le milieu, replacez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance indiqué par la couleur du milieu. Le jour 70, préparez le MDP4. Utilisez le milieu CDM4 jusqu’à ce que l’âge souhaité des organoïdes soit atteint.Pendant cette période, maintenez la plaque sur un agitateur orbital réglé à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance. Préparez une solution de PFA à 4 % et placez-la sous une hotte de sécurité.Recueillez les organoïdes cérébraux et transférez-les doucement avec une pipette Pasteur en plastique émoussée de trois millilitres dans une plaque de six puits remplie de PFA. Conservez les organoïdes dans la solution de PFA pendant une heure à température ambiante. Retirez soigneusement le PFA avec une pipette Pasteur en plastique de trois millilitres et lavez les organoïdes fixes trois fois à l’aide de PBS.Conservez les organoïdes fixes à quatre degrés Celsius dans pbS jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones et aux dendrites. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales, mais aussi des cellules gliales.En utilisant l’analyse des organoïdes cérébraux tranchés, il est possible de surveiller les axones positifs SMI 312 et les dendrites positives MAP2 ou les cellules gliales bêta S100. De plus, les images confocales aident à étudier la distribution détaillée et l’organisation des progéniteurs neuronaux SOX2 positifs en ce qui concerne les neurones positifs à la tubuline bêta-3. Les organoïdes cérébraux ont été colorés pour des marqueurs spécifiques aux mitochondries, tels que la translocase de la membrane externe ou TOM20.Le profilage bioénergétique des organoïdes cérébraux a été réalisé en mesurant à la fois les métabolismes mitochondriaux à l’aide du taux de consommation d’oxygène, ou OCR, et le métabolisme glycolytique à l’aide du taux d’acidification extracellulaire, ou ECAR. L’oligomycine provoque une baisse du profil OCR et identifie donc l’OCR nécessaire à la production d’ATP. Lors du traitement à l’oligomycine, il peut également y avoir une augmentation compensatoire de l’ECAR, ce qui suggère que les cellules peuvent réguler à la hausse la glycolyse pour prévenir le stress métabolique.Lors du transfert des neurosphères de la plaque de 96 puits vers une plaque de culture ou pendant la procédure de fixation, il est crucial de manipuler les organoïdes en douceur pour éviter de les endommager. Après la génération d’organoïdes cérébraux, l’imagerie multi-électrodes ou l’imagerie calcique seraient des méthodes idéales pour tester la fonctionnalité des organoïdes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Recherche

Neurosciences

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

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Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

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Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

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In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

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Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

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