Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Ringraziamo Miriam Bünning per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ad A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), della United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), dell'University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) e del Ministero Federale Tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) (e: Bio giovane investigatore concede AZ 031L0211 ad A.P.). Il lavoro nel laboratorio del C.R.R. è stato sostenuto dal DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

NOTA: L'uso di iPSC umani può richiedere un'approvazione etica. Le iPSC utilizzate in questo studio sono state derivate da individui sani di controllo a seguito dell'approvazione etica locale (# 2019-681). Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite sotto un cappuccio sterile di coltura cellulare, disinfettando accuratamente tutti i reagenti e i materiali di consumo prima di trasferirli sotto il cofano. Le iPSC umane utilizzate per la differenziazione dovrebbero avere un numero di passaggio inferiore ...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Questo articolo descrive la generazione riproducibile di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso per la modellazione della malattia mitocondriale. Il protocollo qui descritto viene modificato sulla base di un lavoro pubblicato in precedenza20. Uno dei principali vantaggi del presente protocollo è che non richiede l'incorporamento manuale di ciascun organoide in una matrice di impalcatura. Infatti, la soluzione della matrice viene semplicemente disciolta nel terreno di coltura cel...

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo1. Sono causati da mutazioni genetiche che interrompono diversi processi mitocondriali, tra cui la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2, l'assemblaggio della catena respiratoria, la dinamica mitocondriale e la trascrizione o la replicazione del DNA mitocondriale3. I tessuti con fabbisogno energetico sono particolarmente colpiti dalla disfunzione mitocondriale4. Di conseguenza, i pazienti con malattie mitocondriali sviluppano tipicamente manifestazioni neurologiche ad esordio precoce.
Attualmente non sono disponibili trattamenti per i bambini affetti da malattie mitocondriali5. Uno dei principali ostacoli allo sviluppo di farmaci per le malattie mitocondriali è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino il decorso della malattia umana6. Molti dei modelli animali attualmente studiati non presentano i difetti neurologici presenti nei pazienti7. Quindi, i meccanismi alla base della patologia neuronale delle malattie mitocondriali non sono ancora completamente compresi.
Studi recenti hanno generato iPSC da pazienti affetti da malattie mitocondriali e hanno utilizzato queste cellule per ottenere cellule neuronali specifiche del paziente. Ad esempio, è stato scoperto che i difetti genetici associati alla malattia mitocondriale, la sindrome di Leigh, causano aberrazioni nella bioenergetica cellulare8,9, nella sintesi proteica10 e nell'omeostasi del calcio9,11. Questi rapporti hanno fornito importanti indizi meccanicistici sulla compromissione neuronale che si verifica nelle malattie mitocondriali, aprendo la strada alla scoperta di farmaci per queste malattie incurabili12.
Le culture bidimensionali (2D), tuttavia, non consentono lo studio della complessità architettonica e dell'organizzazione regionale degli organi 3D13. A tal fine, l'uso di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC specifiche del paziente14 può consentire ai ricercatori di ottenere ulteriori informazioni importanti e quindi aiutare a sezionare come le malattie mitocondriali influenzano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso15. Gli studi che impiegano organoidi cerebrali derivati da iPSC per studiare le malattie mitocondriali stanno iniziando a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. 
Gli organoidi del midollo spinale portatori di mutazioni associate alla malattia mitocondriale, all'encefalopatia mitocondriale, all'acidosi lattica e alla sindrome da episodi simili a ictus (MELAS), hanno mostrato neurogenesi difettosa e differenziazione ritardata dei motoneuroni16. Gli organoidi corticali derivati da pazienti con malattia mitocondriale, sindrome di Leigh, hanno mostrato dimensioni ridotte, difetti nella generazione di gemme epiteliali neurali e perdita dell'architettura corticale17. Gli organoidi cerebrali dei pazienti con sindrome di Leigh hanno dimostrato che i difetti della malattia iniziano a livello delle cellule progenitrici neurali, che non possono impegnarsi nel metabolismo mitocondriale, causando aberranti ramificazioni neuronali e morfogenesi18. Pertanto, i progenitori neurali possono rappresentare un bersaglio terapeutico cellulare per le malattie mitocondriali e le strategie che promuovono la loro funzione mitocondriale possono supportare lo sviluppo funzionale del sistema nervoso.
L'uso di organoidi cerebrali potrebbe aiutare a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. Le malattie mitocondriali sono considerate principalmente come neurodegenerazione ad esordio precoce5. Tuttavia, i difetti dello sviluppo neurologico sono presenti anche nei pazienti affetti da malattie mitocondriali, tra cui ritardo dello sviluppo e deterioramento cognitivo19. Gli organoidi cerebrali specifici del paziente possono aiutare ad affrontare questi aspetti e chiarire come le malattie mitocondriali possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello umano. La disfunzione mitocondriale potrebbe anche svolgere un ruolo patogenetico in altre malattie neurologiche più comuni, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington4. Quindi, chiarire l'impatto dei difetti mitocondriali nel neurosviluppo usando organoidi cerebrali potrebbe anche essere strumentale per lo studio di tali malattie. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali riproducibili che possono essere utilizzati per condurre la modellazione delle malattie mitocondriali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo e sono attualmente incurabili. Queste malattie causano difetti dello sviluppo neurologico i cui meccanismi sottostanti rimangono da chiarire. Un importante ostacolo è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino la compromissione neuronale ad esordio precoce osservata nei pazienti. I progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di organoidi cerebrali tridimensionali (3D) che possono essere utilizzati per studiare l'impatto delle malattie sullo sviluppo e l'organizzazione del sistema nervoso. I ricercatori, compresi questi autori, hanno recentemente introdotto organoidi del cervello umano per modellare i disturbi mitocondriali. Questo documento riporta un protocollo dettagliato per la robusta generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso nella profilazione bioenergetica mitocondriale e nelle analisi di imaging. Questi esperimenti consentiranno l'uso di organoidi cerebrali per studiare le disfunzioni metaboliche e dello sviluppo e possono fornire informazioni cruciali per sezionare la patologia neuronale delle malattie mitocondriali.

Il protocollo qui descritto facilita la robusta generazione di organoidi rotondi (Figura 1A). Gli organoidi generati contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni (SMI312) e dendriti (proteina 2 associata a microtubuli (MAP2)) (Figura 1B). Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali (MAP2-positive) ma anche cellule gliali (ad esempio,...

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Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Questo protocollo mira a utilizzare organoidi cerebrali per studiare le malattie mitocondriali. È stato sviluppato per generare organoidi cerebrali riproducibili nella valutazione delle loro proprietà mitocondriali. Questo metodo non richiede costosi bioreattori e lunghe procedure di incorporamento.Pertanto, è facile da implementare e aggiornare. Questo protocollo consente di generare organoidi cerebrali riproducibili e di testarne le proprietà mitocondriali. Ciò può portare all'identificazione di bersagli interventistici per le malattie dei mitocondri non curabili.Per iniziare, coltivare iPSC umani in condizioni prive di alimentatore in mezzo iPSC su piastre rivestite a sei pozzetti e tenerle in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Passare le iPSC all'80% di confluenza utilizzando il mezzo di distacco privo di enzimi in rapporti che vanno da uno per quattro a uno per 12. Per aumentare la sopravvivenza cellulare, aggiungere 10 protein chinasi micromolari rho-associate o inibitore ROCK dopo ogni scissione.Dissociare l'80% delle iPSC al giorno zero. Preparare il mezzo di differenziazione corticale uno o CDM1 e preriscaldarlo a temperatura ambiente prima di aggiungerlo alle cellule. Lavare i pozzetti contenenti gli iPSC con PBS per rimuovere cellule morte e detriti.Aggiungere 500 microlitri di reagente A preriscaldato a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Controllare al microscopio per garantire il distacco cellulare. Aggiungere un millilitro di mezzo iPSC per diluire il reagente A per neutralizzarne l'attività.Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per dissociare le celle tubando su e giù e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugare delicatamente le iPSC a 125 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare accuratamente il surnatante per evitare di disturbare il pellet cellulare. Risospesciare il pellet con un millilitro di CDM1 per ottenere una sospensione a cella singola e contare il numero di cella.Preparare il terreno di semina con 9.000 iPSC per 100 microlitri in CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre inibitori micromolari della catenina WNT o IWR-1 e cinque micromolari SB-431542. Aggiungere 100 microlitri di terreno di semina per pozzetto a una piastra inferiore a V a 96 pozzetti. Tenere la piastra in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per generare neurosfere, il primo giorno, osserva che si stanno formando aggregati di cellule rotonde con bordi lisci definiti. Si notino le cellule morte intorno agli aggregati. Continuare a coltivare nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il terzo giorno, agitare la piastra toccando i lati tre volte per staccare le cellule morte, quindi aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con 20 inibitori ROCK micromolari, tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto. Tenere la piastra all'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il sesto giorno, rimuovere con cura 80 microlitri del mezzo surnatante da ciascun pozzetto.Evitare di toccare il fondo del pozzo. Aggiungere 100 microlitri di CDM1 integrati con tre micromolari IWR-1 e cinque micromolari SB-431542 a ciascun pozzetto e incubare la piastra. Ripetere il passaggio precedente ogni tre giorni fino al giorno 18.Il giorno 18, per trasferire le neurosfere, preparare CDM2 e aggiungere 10 millilitri a una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri con la punta tagliata per trasferire le neurosfere rotonde dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra di coltura cellulare ad attacco ultra basso da 100 millimetri. Rimuovere cinque millilitri di mezzo dalla piastra contenente le neurosfere e aggiungere cinque millilitri di CDM2 fresco.Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni, aspirare accuratamente il mezzo surnatante e sostituirlo con CDM2 fresco. Lasciare una piccola quantità del mezzo per evitare che le neurosfere si secchino.Il giorno 35, prepara CDM3. Aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 10 millilitri di CDM3 freddo. Dopo aver cambiato il mezzo, riposizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita indicato dal colore del mezzo. Il giorno 70, preparare CDM4. Utilizzare il mezzo CDM4 fino al raggiungimento dell'età desiderata degli organoidi.Durante questo periodo, mantenere la piastra su uno shaker orbitale impostato a 70 rotazioni al minuto all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Cambia il mezzo ogni tre o cinque giorni a seconda del tasso di crescita. Preparare la soluzione al 4% di PFA e posizionarla sotto un cappuccio di sicurezza.Raccogli gli organoidi cerebrali e trasferiscili delicatamente con una pipetta Pasteur di plastica da tre millilitri con punta smussata su una piastra a sei pozzetti piena di PFA. Conservare gli organoidi nella soluzione di PFA per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il PFA con una pipetta Pasteur in plastica da tre millilitri e lavare gli organoidi fissi tre volte utilizzando PBS.Conservare gli organoidi fissi a quattro gradi Celsius in PBS fino a nuovo utilizzo. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni e dendriti. Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali, ma anche cellule gliali.Utilizzando l'analisi degli organoidi cerebrali affettati, è possibile monitorare gli assoni positivi SMI 312 e i dendriti MAP2 positivi o le cellule beta gliali S100. Inoltre, le immagini confocali aiutano a studiare la distribuzione dettagliata e l'organizzazione dei progenitori neurali positivi SOX2 rispetto ai neuroni beta-3 positivi alla tubulina. Gli organoidi cerebrali sono stati colorati per marcatori specifici dei mitocondri, come translocase della membrana esterna o TOM20.Il profilo bioenergetico degli organoidi cerebrali è stato eseguito misurando sia il metabolismo mitocondriale utilizzando il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, sia il metabolismo glicolitico utilizzando il tasso di acidificazione extracellulare, o ECAR. L'oligomicina provoca un calo del profilo OCR e quindi identifica l'OCR necessario per la produzione di ATP. Dopo il trattamento con oligomicina, ci può anche essere un aumento compensatorio dell'ECAR suggerendo che le cellule possono sovraregolare la glicolisi per prevenire lo stress metabolico.Quando si trasferiscono le neurosfere dalla piastra a 96 pozzetti a una piastra di coltura o durante la procedura di fissaggio, è fondamentale maneggiare delicatamente gli organoidi per evitare di danneggiarli. Dopo la generazione di organoidi cerebrali, l'array multi-elettrodo o l'imaging del calcio sarebbero metodi ideali per testare la funzionalità degli organoidi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

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