Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

기술 지원을 위해 미리암 뷔닝에게 감사드립니다. 우리는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)(PR1527/5-1 ~A.P.), 스파크 및 베를린 보건연구소(BIH)(BIH 유효성 검사 기금 A.P.), 유나이티드 미의 지원을 인정합니다. 토콘드리아 질병 재단 (UMDF) (A.P.에 리 증후군 국제 컨소시엄 보조금), 대학 병원 뒤셀도르프 (Forschungskommission UKD 에 A.P.), 독일 연방 교육 및 연구부 (BMBF) (e: 바이오 젊은 조사관은 A.P.에 AZ 031L0211을 부여합니다. C.R.R.의 실험실에서 의 작업은 DFG에 의해 지원되었다 (FOR 2795 "스트레스아래 시냅스", Ro 2327/13-1).

참고: 인간 ipC를 사용하려면 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 iPSC는 지역 윤리 승인(#2019-681)에 따라 건강한 대조군 개인에게서 파생되었습니다. 모든 세포 배양 절차는 멸균 세포 배양 후드하에서 수행되어야하며, 후드 아래에 옮기기 전에 모든 시약과 소모품을 신중하게 소독해야합니다. 분화에 사용되는 인간 iPSC는 광범위한 문화권에서 발생할 수 있는 잠재적인 게놈 수?...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고...

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타냅니다1. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)2, 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 3. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애4에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.
미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다5. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다7. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.
최근 연구는 미토콘드리아 질환에 의해 영향을 받는 환자에서 iPSC를 생성 하 고 환자 특정 신경 세포를 얻기 위해 이러한 세포를 사용. 예를 들어, 미토콘드리아 질환, 리 증후군과 관련된 유전적 결함은 세포 생체 에너지8,9, 단백질 합성10 및 칼슘 항상성9,11에서 수차를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이 보고는 미토콘드리아 질병에서 생기는 신경 손상에 중요한 기계론단서를 제공했습니다, 이 불치병을 위한 약 발견을 위한 도로를 포장12.
그러나 2차원(2D) 문화는 3D 기관의 건축복잡성및 지역조직에 대한 조사를 가능하게 하지 않는다13. 이를 위해 환자별 iPSCs14 에서 추출한 3D 뇌 오르가노이드를 사용하면 연구원이 추가적인 중요한 정보를 얻을 수 있으며 이로 인해 미토콘드리아 질환이 신경계의 개발 및 기능에 미치는 영향을 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다15. 미토콘드리아 질환을 조사하기 위해 iPSC 유래 뇌 오르가노이드를 사용하는 연구는 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 밝히기 시작했다. 
미토콘드리아 질환, 미토콘드리아 뇌병증, 젖산증 및 뇌졸중과 같은 에피소드 증후군(MELAS)과 관련된 돌연변이를 운반하는 척수 오르가노이드는 결함이 있는 신경 발생 및 지연된 운동 뉴런 분화를 보였다16. 미토콘드리아 질환, 리 증후군 환자에서 유래한 피질 오르간노이드는 크기 감소, 신경 상피 싹 생성의 결함 및 피질 아키텍처의 손실을 보였다17. 리 증후군 환자에서 뇌 오르가노이드는 질병 결함이 미토콘드리아 대사에 투입 할 수없는 신경 전구 세포의 수준에서 시작 것으로 나타났다, 비정상적인 신경 분지 및 형태 발생을 일으키는 18. 따라서, 신경 전조자는 미토콘드리아 질환에 대한 세포 치료 표적을 나타낼 수 있으며, 미토콘드리아 기능을 촉진하는 전략은 신경계의 기능적 발달을 지원할 수 있다.
뇌 오르가노이드의 사용은 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아 질환은 주로 조기 발병 신경 변성5로 간주됩니다. 그러나, 신경 발달 결점은 또한 발달 지연 및 인지 장애를 포함하여 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 환자에서 존재합니다19. 환자 별 뇌 오르가노이드는 이러한 측면을 해결하고 미토콘드리아 질환이 인간의 뇌 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 설명합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 또한 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴병4와 같은 다른 일반적인 신경 질환에서 병역적 역할을 할 수 있습니다. 따라서 뇌 오르가노이드를 사용하여 신경 발달에 미토콘드리아 결함의 영향을 해명하는 것도 이러한 질병의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 이 논문은 미토콘드리아 질환의 질병 모델링을 수행하는 데 사용할 수있는 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 둥근 오르가노이드의 견고한 생성을 용이하게 한다 (그림 1A). 생성된 오르가노이드는 축산(SMI312) 및 원원수(microtubule-관련 단백질 2(MAP2)에 특이적인 단백질 마커를 사용하여 시각화될 수 있는 성숙한 뉴런 (도 1B)을 함유하고 있다. 성숙한 오르가노이드는 뉴런 세포(MAP2 양성) 뿐만 아니라 ...

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Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

이 프로토콜은 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 뇌 오르가노이드를 사용하는 것을 목표로합니다. 그것은 그들의 미토콘드리아 속성의 평가에 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 개발되었다. 이 방법은 고가의 생물 반응기와 시간이 많이 소요되는 포함 절차를 필요로하지 않습니다.따라서 구현하기 쉽고 고급스입니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하고 미토콘드리아 특성을 테스트 할 수 있게합니다. 이것은 치료할 수 없는 미토콘드리아 질병을 위한 내정간섭 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다.우선, 코팅된 6웰 플레이트의 iPSC 배지에서 피더가 없는 조건에서 인간 iPSC를 배양하고 가습화된 조직 배양 배양인인 배양기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지한다. iPSC를 효소 없는 분리 배지를 사용하여 80%의 결합으로 통과하여 1대 4에서 12까지 의 비율로 측정합니다. 세포 생존을 증가시키기 위하여는, 각 분할 후에 10 개의 micromolar rho 관련 단백질 키나아제 또는 ROCK 억제제를 추가합니다.0일차면 80%의 iPSC를 분리합니다. 피질 분화 매체 1 또는 CDM1을 준비하고 세포에 추가하기 전에 실온에서 미리 데워보도록 하십시오. 죽은 세포와 파편을 제거하기 위해 PBS와 iPSC를 포함하는 우물을 세척합니다.500 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 시약 A를 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 현미경으로 확인하여 세포 분리를 보장하십시오. iPSC 배지 1밀리리터를 추가하여 시약 A를 희석하여 활동을 중화시합니다.1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 세포를 위아래로 배관하여 세포를 해리하고 셀 서스펜션을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. iPSCs를 실온에서 5분 동안 125회 G로 부드럽게 원심분리한 다음, 셀 펠릿을 방해하지 않도록 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 단일 셀 현탁액을 얻고 세포 수를 계산하기 위해 CDM1의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다.CDM1내 100마이크로리터당 9, 000iPSC, 마이크로몰러 WNT 카테닌 억제제 또는 IWR-1 3개, 마이크로몰러 SB-431542로 파종 배지를 준비한다. 잘 100 마이크로리터의 파종 매체를 96웰 V 하단 플레이트에 추가합니다. 플레이트를 가습 조직 배양 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하십시오.신경구를 생성하기 위하여는, 첫날에, 정의된 매끄러운 테두리를 가진 둥근 세포 응집체가 형성되고 있다는 것을 관찰합니다. 골재 주위의 죽은 세포를 기록합니다. 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 문화를 계속 합니다.셋째 날에는 양면을 세 번 눌러 죽은 세포를 분리한 다음 20마이크로몰러 ROCK 억제제, 3개의 마이크로몰러 IWR-1, 5개의 마이크로몰러 SB-431542로 보충된 CDM1 의 마이크로리터 100개를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 보관하십시오. 6일째에는 각 우물에서 상피 배지의 80마이크로리터를 조심스럽게 제거합니다.우물의 바닥을 만지지 마십시오. 3개의 마이크로몰러 IWR-1과 5개의 마이크로몰러 SB-431542로 보충된 CDM1의 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 배양합니다. 18일까지 3일마다 이전 단계를 반복합니다.18일째에 신경구를 옮기고 CDM2를 준비하고 100mm 초저 부착 세포 배양판에 10 밀리리터를 추가합니다. 팁이 잘린 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 100mm 초저 부착 세포 배양 판으로 둥근 신경구를 전달합니다. 신경구를 포함하는 접시에서 5 밀리리터의 매체를 제거하고 신선한 CDM2의 5 밀리리터를 추가합니다.가습조직 배양 배양기 내부에 분당 70회 회전하여 플레이트를 궤도 셰이커에 놓습니다. 3일마다 슈퍼내트 매체를 조심스럽게 흡인하고 신선한 CDM2로 교체하십시오. 소량의 배지를 남겨 신경구가 건조되는 것을 방지하십시오.35일째, CDM3를 준비합니다. 접시에서 매체를 흡인하고 차가운 CDM3의 10 밀리리터를 추가합니다. 매체를 변경한 후, 가습조직 배양배 인큐베이터 내부에 분당 70회전에서 플레이트를 다시 궤도 셰이커에 다시 놓습니다.매체의 색에 표시된 대로 성장 속도에 따라 3~5일마다 배지를 변경합니다. 70일째되면 CDM4를 준비합니다. 원하는 오르가노이드 에 도달할 때까지 CDM4 배지를 사용합니다.이 기간 동안, 37섭씨 와 5%의 이산화탄소에서 가습조직 배양 배양내부의 분당 70회전으로 설정된 궤도 셰이커에 플레이트를 보관하십시오. 성장률에 따라 3~5일마다 배지를 변경합니다. 4% PFA 솔루션을 준비하고 안전 후드 아래에 놓습니다.뇌 오르가노이드를 수집하고 부드럽게 PFA로 채워진 6 웰 플레이트에 무딘 팁 세 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 전송합니다. 실온에서 1시간 동안 PFA 용액에 오르가노이드를 보관하십시오. 3밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 PFA를 조심스럽게 제거하고 PBS를 사용하여 고정 된 오르가노이드를 세 번 세척하십시오.고정 된 오르가노이드를 PBS에 섭씨 4도에 저장하여 추가 사용까지 보관하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 오르가노이드에는 축선 및 담장에 특정한 단백질 마커를 사용하여 시각화할 수 있는 성숙한 뉴런이 포함되어 있습니다. 성숙한 오르가노이드는 신경 세포뿐만 아니라 신경 세포도 포함합니다.슬라이스 된 뇌 오르가노이드 분석을 사용하여 SMI 312 양성 축록산 및 MAP2 양성 펜드라이트 또는 S100 베타 신경교 세포를 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 공초점 심은 베타-3 튜룰린 양성 뉴런에 대하여 SOX2 양성 신경 전구의 상세한 분포 및 조직을 조사하는 데 도움이 됩니다. 뇌 오르가노이드는 외부 막 또는 TOM20의 트랜스로케이스와 같은 미토콘드리아 특이적 마커를 위해 염색되었다.뇌 오르가노이드의 생체 에너지 프로파일링은 산소 소비속도, 또는 OCR, 및 세포외 산성화 율 또는 ECAR를 이용한 글리코리스틱 대사를 모두 측정하여 수행되었다. OligomycinOCR 프로파일의 하락을 야기하므로 ATP 생산에 필요한 OCR을 식별합니다. 올리고마이신 치료에 따라, 또한 ECAR의 보상 증가가 있을 수 있습니다 세포가 신진 대사 스트레스를 방지하기 위해 혈당을 조절 할 수 있음을 시사.96웰 플레이트에서 배양 판으로 신경구를 옮기거나 고정 시술 중에 유기체를 부드럽게 처리하여 손상을 입히지 않도록 하는 것이 중요합니다. 뇌 오르가노이드의 생성에 따라, 다중 전극 배열 또는 칼슘 이미징은 오르가노이드의 기능을 테스트하는 이상적인 방법이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

뇌 구조의 3차원 형상 모델링 및 분석

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...