Name: generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Vi tackar Miriam Bünning för teknisk support. Vi bekräftar stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 till A.P.), Spark och Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (BMBF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD till A.P.) och Det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF Bio young investigator bevilja AZ 031L0211 till A.P.). Arbetet i laboratoriet för C.R.R. stöddes av DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

ANVÄNDNING av mänskliga iPSCs kan kräva ett etiskt godkännande. iPSCs som användes i denna studie härleddes från friska kontrollpersoner efter lokalt etiskt godkännande (#2019-681). Alla cellodlingsförfaranden måste utföras under en steril cellodlingshuv, desinficera noggrant alla reagenser och förbrukningsvaror innan de överförs under huven. Mänskliga iPSCs används för differentiering bör ha ett passagenummer under 50 för att undvika potentiella genomiska avvikelser som kan uppstå på omfattande kult...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

Detta dokument beskriver reproducerbar generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning för mitokondriell sjukdom modellering. Protokollet som beskrivs här ändras baserat på ett tidigare publicerat verk20. En stor fördel med det nuvarande protokollet är att det inte kräver manuell inbäddning av varje organoid i en byggnadsställningsmatris. Faktum är att matrislösningen helt enkelt löses upp i cellodlingsmediet. Dessutom finns det inget behov av att anv?...

Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen1. De orsakas av genetiska mutationer som stör olika mitokondriella processer, inklusive oxidativ fosforylering (OXPHOS)2, andningskedjemontering, mitokondriell dynamik och mitokondriell DNA-transkription eller replikering3. Vävnader med energibehov påverkas särskilt av mitokondriell dysfunktion4. Följaktligen utvecklar patienter med mitokondriella sjukdomar vanligtvis tidiga neurologiska manifestationer.
Det finns för närvarande inga behandlingar tillgängliga för barn som drabbats av mitokondriella sjukdomar5. Ett stort hinder för läkemedelsutveckling av mitokondriella sjukdomar är bristen på effektiva modeller som rekapitulerar den mänskliga sjukdomskursen6. Flera av de för närvarande studerade djurmodellerna uppvisar inte de neurologiska defekter som finns hos patienterna7. Därför är mekanismerna bakom den neuronala patologin av mitokondriella sjukdomar fortfarande inte helt förstådda.
Nyligen genomförda studier genererade iPSCs från patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar och använde dessa celler för att erhålla patientspecifika neuronala celler. Till exempel har genetiska defekter associerade med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visat sig orsaka avvikelser i cellulära bioenergetik8,9, proteinsyntes10 och kalciumhomeostas9,11. Dessa rapporter gav viktiga mekanistiska ledtrådar om neuronal nedskrivningar förekommer i mitokondriella sjukdomar, banar väg för läkemedelsupptäckt för dessa obotliga sjukdomar12.
Tvådimensionella (2D) kulturer möjliggör dock inte undersökningen av den arkitektoniska komplexiteten och den regionala organisationen av 3D-organ13. För detta ändamål kan användningen av 3D-hjärnorganoider som härrör från patientspecifika iPSCs14 göra det möjligt för forskare att få ytterligare viktig information och därmed bidra till att dissekera hur mitokondriella sjukdomar påverkar nervsystemets utveckling och funktion15. Studier som använder iPSC-härledda hjärnorganoider för att undersöka mitokondriella sjukdomar börjar avslöja de neurodevelopmentala komponenterna i mitokondriella sjukdomar. 
Ryggmärg organoider bär mutationer som är associerade med mitokondriell sjukdom, mitokondriell encefalopati, mjölksyra acidos och stroke-liknande episoder syndrom (MELAS), visade defekt neurogenesis och fördröjd motor neuron differentiering16. Närorganoider härrör från patienter med mitokondriell sjukdom, Leigh syndrom, visade minskad storlek, defekter i neurala epitelial bud generation och förlust av när arkitektur17. Hjärnan organoider från Leigh syndrom patienter visade att sjukdomen defekter initiera på nivån av neurala stamceller, som inte kan förbinda sig till mitokondriell metabolism, orsakar avvikande neuronal förgrening och morfogenesi18. Således kan neurala stamceller representera ett cellulärt terapeutiskt mål för mitokondriella sjukdomar, och strategier som främjar deras mitokondriella funktion kan stödja nervsystemets funktionella utveckling.
Användningen av hjärnan organoider kan hjälpa till att avslöja neurodevelopmental komponenter av mitokondriella sjukdomar. Mitokondriella sjukdomar anses främst vara tidiga neurodegeneration5. Neurodevelopmental defekter finns dock också hos patienter som drabbats av mitokondriella sjukdomar, inklusive utvecklingsmässiga dröjsmål och kognitiv svikt19. Patientspecifika hjärnorganoider kan hjälpa till att ta itu med dessa aspekter och belysa hur mitokondriella sjukdomar kan påverka människans hjärnutveckling. Mitokondriell dysfunktion kan också spela en patogenetisk roll i andra vanligare neurologiska sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom4. Därför kan klargöra effekterna av mitokondriella defekter i neuroutveckling med hjälp av hjärnan organoider också vara avgörande för studien av dessa sjukdomar. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att generera reproducerbara hjärnan organoider som kan användas för att genomföra sjukdom modellering av mitokondriella sjukdomar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

Mitokondriella sjukdomar representerar den största klassen av medfödda fel i ämnesomsättningen och är för närvarande obotliga. Dessa sjukdomar orsakar neurodevelopmental defekter vars underliggande mekanismer återstår att klargöra. En stor vägspärr är bristen på effektiva modeller recapitulating den tidiga debuten neuronal nedskrivningar sett hos patienterna. Framsteg inom tekniken för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av tredimensionella (3D) hjärnorganoider som kan användas för att undersöka effekterna av sjukdomar på nervsystemets utveckling och organisation. Forskare, inklusive dessa författare, har nyligen introducerat mänskliga hjärnorganoider för att modellera mitokondriella störningar. Detta dokument rapporterar ett detaljerat protokoll för robust generering av mänskliga iPSC-härledda hjärnan organoider och deras användning i mitokondriell bioenergetic profilering och imaging analyser. Dessa experiment kommer att tillåta användning av hjärnan organoider att undersöka metabola och utvecklingsmässiga dysfunktioner och kan ge avgörande information för att dissekera neuronal patologi av mitokondriella sjukdomar.

Protokollet som beskrivs här underlättar den robusta genereringen av runda organoider (figur 1A). De genererade organoiderna innehåller mogna nervceller som kan visualiseras med hjälp av proteinmarkörer som är specifika för axoner (SMI312) och dendriter (mikrotubuleassocierat protein 2 (MAP2)) (figur 1B). Mogna organoider innehåller inte bara neuronala celler (MAP2-positiva) utan även gliaceller (t.ex. ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga inducerade pluripotenta stamcell-härledda hjärnan organoider och deras användning i modellering mitokondriell sjukdomar.

Generation av mänskliga hjärnorganoider för mitokondriell sjukdom modellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Detta protokoll syftar till att använda hjärnan organoider för att studera mitokondriella sjukdomar. Det utvecklades för att generera reproducerbara hjärnan organoider i bedömningen av deras mitokondriella egenskaper. Denna metod kräver inte dyra bioreaktorer och tidskrävande inbäddningsprocedurer.Därför är det lätt att implementera och skala upp. Detta protokoll gör det möjligt att generera reproducerbara hjärnan organoider och att testa deras mitokondriella egenskaper. Detta kan leda till identifiering av interventionella mål för obehandlade mitokondrier sjukdomar.Till att börja med odla mänskliga iPSCs under matarfria förhållanden i iPSC-medium på belagda sexbrunnplattor och håll dem i en fuktad vävnadskulturinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Passage iPSCs vid 80% sammanflöde med enzymfritt lösgöringsmedium i förhållanden som sträcker sig från en med fyra till en med 12. För att öka cellens överlevnad, tillsätt 10 mikromolar rho-associerade proteinkinas eller ROCK-hämmare efter varje delning.Dissociera 80% iPSCs på dag noll. Förbered kortikal differentieringsmedel ett eller CDM1 och förvärm det vid rumstemperatur innan du lägger till det i cellerna. Tvätta brunnarna som innehåller iPSCs med PBS för att ta bort döda celler och skräp.Tillsätt 500 mikroliter förvärmt reagens A till varje brunn och inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius. Kontrollera under mikroskopet för att säkerställa cellavlossning. Tillsätt en milliliter iPSC-medium för att späda reagens A för att neutralisera dess aktivitet.Använd en 1 000 mikroliterpipetter för att separera cellerna genom att röra upp och ner och överföra cellfjädringen till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera försiktigt iPSCs vid 125 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur och aspirera sedan försiktigt supernatanten för att undvika att störa cellpelleten. Återanvänd pelleten med en milliliter CDM1 för att få en enda cellupphängning och räkna cellnumret.Förbered såddmediet med 9 000 iPSC per 100 mikroliter i CDM1 kompletterat med 20 mikromolära ROCK-hämmare, tre mikromolära WNT-kaninhämmare eller IWR-1 och fem mikromolära SB-431542. Tillsätt 100 mikroliter såddmedium per brunn till en 96-well V bottenplatta. Håll plattan i en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.För att generera neurosfärer, på dag ett, observera att runda cellaggregat med definierade släta gränser bildas. Notera de döda cellerna runt aggregaten. Fortsätt att odla i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.På dag tre, agitera plattan genom att knacka på sidorna tre gånger för att lossa döda celler, tillsätt sedan 100 mikroliter CDM1 kompletterad med 20 mikromolar ROCK-hämmare, tre mikromolära IWR-1 och fem mikromolära SB-431542 till varje brunn. Håll plattan till inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. På dag sex tar du försiktigt bort 80 mikroliter av det supernatantmediet från varje brunn.Undvik att vidröra botten av brunnen. Tillsätt 100 mikroliter CDM1 kompletterat med tre mikromolära IWR-1 och fem mikromolära SB-431542 till varje brunn och inkubera plattan. Upprepa föregående steg efter var tredje dag fram till dag 18.På dag 18, för att överföra neurosfärer, förbereda CDM2 och tillsätt 10 milliliter till en 100 millimeter ultra låg fastsättning cell odlingsplatta. Använd en 200 mikroliterpipetter med spetsen avskuren för att överföra de runda neurosfärerna från 96-brunnsplattan till 100 millimeters ultralågtillsättningscellsodlingsplatta. Ta bort fem milliliter medium från plattan som innehåller neurosfärerna och tillsätt fem milliliter färsk CDM2.Placera plattan på en orbital shaker vid 70 rotationer per minut inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Var tredje dag, aspirera försiktigt det supernatantmediet och ersätt det med färsk CDM2. Lämna en liten mängd av mediet för att förhindra att neurosfärer torkar ut.Förbered CDM3 på dag 35. Aspirera mediet från plattan och tillsätt 10 milliliter kall CDM3. Efter att ha bytt medium, placera plattan tillbaka på en orbital shaker vid 70 rotationer per minut inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Byt medium var tredje till femte dag beroende på tillväxttakten som indikeras av mediets färg. På dag 70 förbereder du CDM4. Använd CDM4 medium tills önskad ålder av organoider uppnås.Under denna period, håll plattan på en orbital shaker inställd på 70 rotationer per minut inuti en fuktad vävnadsodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Byt medium var tredje till femte dag beroende på tillväxttakten. Förbered 4% PFA-lösning och placera den under en säkerhetshuv.Samla hjärnorganoider och överför dem försiktigt med en trubbig tippad pasteurpipeett av tre milliliter plast till en sex-brunnsplatta fylld med PFA. Förvara organoiderna i PFA-lösningen i en timme i rumstemperatur. Ta försiktigt bort PFA med en pasteurpipeett av tre milliliter plast och tvätta de fasta organoiderna tre gånger med PBS.Förvara de fasta organoiderna vid fyra grader Celsius i PBS tills vidare användning. De organoider som genereras med hjälp av detta protokoll innehåller mogna nervceller som kan visualiseras med hjälp av proteinmarkörer som är specifika för axoner och dendriter. Mogna organoider innehåller inte bara neuronala celler, men också gliaceller.Med hjälp av skivad analys av hjärnorganoider är det möjligt att övervaka SMI 312 positiva axoner och MAP2-positiva dendriter eller S100 beta gliaceller. Vidare hjälper konfokala bilder att undersöka detaljerad distribution och organisation av SOX2 positiva neurala stamceller med avseende på beta-3 tubulin positiva nervceller. Hjärnan organoider var färgade för mitokondrier-specifika markörer, såsom translocase av yttre membran eller TOM20.Bioenergetic profilering av hjärnan organoider utfördes genom att mäta både mitokondriell metabolismer med hjälp av syreförbrukning, eller OCR, och den glykolytiska metabolismen med hjälp av extracellulär försurning hastighet, eller ECAR. Oligomycin orsakar en minskning av OCR-profilen och identifierar därför den OCR som behövs för ATP-produktion. Vid oligomycinbehandling kan det också finnas en kompensatorisk ökning av ECAR som tyder på att cellerna kan uppreglera glykolys för att förhindra den metaboliska stressen.Vid överföring av neurosfärerna från 96-brunnsplattan till en odlingsplatta eller under fixeringsförfarandet är det viktigt att hantera organoiderna försiktigt för att undvika att skada dem. Efter generering av hjärnan organoider, multi-elektrod array eller kalcium imaging skulle vara idealiska metoder för att testa funktionaliteten hos organoider.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Beredning av Oligomer β-amyloid 1-42 Och induktion av synaptisk plasticitet Nedskrivning av hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondriell Ca2 + Retention kapacitet Assay och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Singel-molekyl spårning i Drosophila presynaptiska Motor nerv terminalen

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionell form modellering och analys av hjärnstrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humana neuroner och oligodendrocyter från pluripotenta stamceller för modellering av neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flödescytometrisk analys av flera mitokondriella parametrar i humaninducerade pluripotenta stamceller och deras neurala och glialderivat

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...