Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

نشكر روب إيفرت على مساعدته في تصميم وتحسين شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة بالليزر. تم دعم هذا العمل من قبل مركز السرطان CSHL (P30-CA045508) وأموال ل M.E. من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01CA2374135 و 5P01CA013106-49) ؛ CSHL ونورثويل هيلث; مؤسسة عائلة طومسون؛ السباحة في جميع أنحاء أمريكا. ومنحة من مؤسسة سيمونز إلى CSHL. تم دعم MS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة جائزة تدريب العلماء الطبيين (T32-GM008444) والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1F30CA253993-01. L.M. مدعوم من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جيمس إس ماكدونيل. حصل J.M.A. على زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد أبحاث السرطان / Irvington (جائزة CRI # 3435). يتم دعم D.A.T. من قبل مختبر مؤسسة لوستغارتن المخصص لأبحاث سرطان البنكرياس ومؤسسة عائلة طومسون. تم إنشاء الرسوم المتحركة مع Biorender.com.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية الجراحية لمختبر كولد سبرينج هاربور وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مختبر كولد سبرينج هاربور.
1. صب نافذة السيليكون 
<ol><li>تحضير بوليمر السيليكون (PDMS) عن طريق خلط المط...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

تعد نوافذ التصوير داخل الحيوية أدوات مهمة للتصور المباشر للعمليات الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية أثناء تكشفها بمرور الوقت. يتغلب الإجراء الجديد الموصوف لصب وإدخال نوافذ تصوير مرنة من السيليكون في الفئران على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا (الإفرازات والكسر...

يقدم الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) ، وهو تصوير الأنسجة في الحيوانات المخدرة ، نظرة ثاقبة على ديناميكيات الأحداث الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية في الأنسجة السليمة. تختلف تطبيقات هذه التقنية على نطاق واسع ، ولكن IVM كان له دور فعال في مجال بيولوجيا السرطان للمساعدة في توضيح كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة وانتشارها ، والتفاعل مع البيئة الدقيقة المحيطة ، والاستجابة للأدوية1،2،3. بالإضافة إلى ذلك ، كان IVM مفتاحا لتعزيز فهم الآليات المعقدة التي تحكم الاستجابات المناعية من خلال توفير رؤى مكملة لنهج التنميط خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي). على سبيل المثال ، كشفت تجارب التصوير داخل الحيوية عن تفاصيل حول وظائف المناعة من حيث صلتها بهجرة الخلايا والاتصال الخلوي الخلوي وقدمت منصة لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية استجابة للإصابة أو العدوى4،5،6،7. يمكن أيضا دراسة العديد من هذه العمليات من خلال التلطيخ النسيجي ، ولكن IVM فقط يسمح بتتبع التغييرات الديناميكية. في الواقع ، في حين أن القسم النسيجي يقدم لقطة للأنسجة في وقت معين ، يمكن للتصوير داخل الحيوية تتبع الأحداث بين الخلايا وتحت الخلايا داخل نفس النسيج بمرور الوقت. على وجه الخصوص ، سمح التقدم في وضع العلامات الفلورية وتطوير المراسلين الجزيئيين بربط الأحداث الجزيئية بالسلوكيات الخلوية ، مثل الانتشار والموت والحركة والتفاعل مع الخلايا الأخرى أو المصفوفة خارج الخلية. تعتمد معظم تقنيات IVM على الفحص المجهري الفلوري ، والذي بسبب تشتت الضوء ، يجعل تصوير الأنسجة العميقة أمرا صعبا. لذلك ، غالبا ما تحتاج الأنسجة المثيرة للاهتمام إلى التعرض جراحيا من خلال إجراء جراحي ونهائي في كثير من الأحيان. وبالتالي ، اعتمادا على موقع العضو ، يمكن تصوير الأنسجة بشكل مستمر لفترة تتراوح من عدد قليل إلى 40 ساعة8. بدلا من ذلك ، يسمح الإدخال الجراحي لنافذة تصوير دائمة بتصوير نفس الأنسجة بالتتابع على مدى فترة من الأيام إلى الأسابيع 7,9.
تم تسليط الضوء على تطوير نوافذ تصوير جديدة كحاجة تكنولوجية لزيادة تحسين أساليب التصوير داخل الحيوية10. نافذة التصوير النموذجية داخل الحيوية هي حلقة معدنية تحتوي على غطاء زجاجي مثبت على الجلد باستخدام خيوط11. التداخل مع حرية الحركة ، وتراكم الإفرازات ، وتلف الغطاء الزجاجي هي مشاكل شائعة شوهدت مع استخدام هذه النوافذ. علاوة على ذلك ، تتطلب النافذة النموذجية إنتاجا متخصصا ، ويمكن أن يتطلب الإجراء الجراحي تدريبا مكثفا. لمعالجة هذه القضايا ، تم تكييف polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون ، والذي تم استخدامه سابقا في نوافذ الجمجمة للتصوير طويل الأجل في الدماغ12 ، للاستخدام في تصوير أعضاء البطن والغدة الثديية. هنا ، يتم تقديم طريقة مفصلة لتوليد نوافذ السيليكون القائمة على PDMS ، بما في ذلك كيفية إلقاء النافذة حول شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتم وصف إجراء جراحي بسيط وخالي من الغرز لإدخال النافذة فوق أعضاء البطن أو الغدة الثديية. يتغلب هذا النهج الجديد على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا ويزيد من إمكانية الوصول إلى التصوير الطولي داخل الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

يتيح الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) تصور حركة الخلية وانقسامها وموتها بدقة خلية واحدة. IVM من خلال نوافذ التصوير التي يتم إدخالها جراحيا قوية بشكل خاص لأنها تسمح بالمراقبة الطولية لنفس الأنسجة على مدار أيام إلى أسابيع. تشتمل نوافذ التصوير النموذجية على غطاء زجاجي في إطار معدني متوافق حيويا يتم خياطته على جلد الماوس. يمكن أن تتداخل هذه النوافذ مع الحركة الحرة للفئران ، وتثير استجابة التهابية قوية ، وتفشل بسبب الزجاج المكسور أو الغرز الممزقة ، والتي قد يتطلب أي منها القتل الرحيم. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير نوافذ لتصوير أعضاء البطن والغدة الثديية على المدى الطويل من فيلم رقيق من polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون شفاف بصريا كان يستخدم سابقا لنوافذ التصوير في الجمجمة. يمكن لصق هذه النوافذ مباشرة على الأنسجة ، مما يقلل من الوقت اللازم للإدخال. يتميز نظام PDMS بالمرونة ، مما يساهم في متانته في الفئران بمرور الوقت - تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما. التصوير الطولي هو تصوير لنفس منطقة الأنسجة خلال جلسات منفصلة. تم تضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النوافذ لتوطين نفس المنطقة ، مما يسمح بتصور العمليات الديناميكية (مثل التفاف الغدة الثديية) في نفس المواقع ، بفارق أيام. سمحت نافذة السيليكون هذه أيضا بمراقبة الخلايا السرطانية المنتشرة المفردة التي تتطور إلى نقائل صغيرة بمرور الوقت. نوافذ السيليكون المستخدمة في هذه الدراسة أبسط في الإدخال من النوافذ الزجاجية ذات الإطار المعدني وتسبب التهابا محدودا في الأنسجة المصورة. علاوة على ذلك ، تسمح الشبكات المدمجة بالتتبع المباشر لنفس منطقة الأنسجة في جلسات التصوير المتكررة.

يمكن استخدام التصوير داخل الحيوية من خلال نوافذ التصوير لمراقبة وتتبع وتحديد مجموعة واسعة من الأحداث الخلوية والجزيئية بدقة خلية واحدة على مدى فترة من ساعات إلى أسابيع. وتشمل الميزات المثالية لنافذة التصوير ما يلي: (أ) التأثير المحدود على رفاه الفأر وفسيولوجيا الأنسجة؛ (ب) التأثير المحدو?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

يتم تقديم نهج هنا للتصوير داخل الحيوية على المدى الطويل باستخدام نوافذ سيليكون واضحة بصريا يمكن لصقها مباشرة على الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد. هذه النوافذ أرخص وأكثر تنوعا من غيرها المستخدمة حاليا في هذا المجال ، ويسبب الإدخال الجراحي التهابا محدودا وضيقا للحيوانات.

التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

هذا الإجراء لصب وإدخال نوافذ السيليكون يقلل من الحواجز التقنية للتصوير الطولي داخل الحيوية. ينتج بروتوكولنا نوافذ قوية وقابلة للتكيف بسهولة وتتحملها الحيوانات بشكل جيد. باستخدام هذه التقنية ، قمنا بتصوير الخلايا السرطانية والمناعية في الكبد والبنكرياس والغدة الثديية.مع الحد الأدنى من التعديلات ، يمكن تكييفها مع العديد من المواقع التشريحية والأسئلة البيولوجية. بالنسبة لأولئك الذين يجربون هذه التقنية لأول مرة ، تدرب على إطلاق كميات صغيرة من الغراء من المحقنة. سيؤدي تطبيق الكثير من الغراء إلى تعتيم مجال التصوير ويجعل من الصعب التعامل مع المنطقة الجراحية.ابدأ في صب نافذة السيليكون عن طريق إيداع كمية صغيرة من بوليمر السيليكون الطازج ، polydimethylsiloxane ، من PDMS ، على سطح أملس نظيف ، وضبط نسبة الحجم إلى المنطقة للحصول على السماكة المطلوبة. بمجرد ترسب PDMS على سطح الصب المطلوب ، اضغط برفق على شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ في السيليكون لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. لإزالة فقاعات الهواء وإزالة بوليمر السيليكون ، ضع السطح المطلي في مجفف فراغ لمدة 45 دقيقة.عند الانتهاء ، عالج البوليمر في فرن عند 75 إلى 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. سجل البوليمر عند حواف القالب واستخدم الملقط لتقشير النوافذ المعالجة بلطف من السطح المستخدم في الصب. ضع الماوس على موضع الاستلقاء الجانبي الأيسر.قم بإعداد الفأر المخدر للجراحة عن طريق تطبيق 10٪ من الحجم من محلول اليود البوفيدون و 70٪ من الحجم من الإيثانول ثلاث مرات متتالية على موقع الجراحة المحلوق. يجب توخي الحذر للحفاظ على مجال جراحي معقم. بعد ذلك ، استخدم مقص وملقط معقم لإجراء شق 10 ملم على الجناح الأيمن عند ثلاثة ملليمترات أسفل القوس الساحلي.قم بإزالة قسم سنتيمتر مربع واحد من الجلد واستخدم زوجا ثانيا من المقص المعقم والملقط لإزالة جزء من الصفاق أصغر قليلا من قسم الجلد. قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على صفيحة بئر معقمة واسحبها باستخدام حقنة قياس 31 لتطبيقها على سطح الكبد حول حواف المنطقة المراد تصويرها ، ثم ضع النافذة على المنطقة المطلوبة ، وأمسكها بإحكام على الكبد لمدة دقيقتين تقريبا حتى تجف المادة اللاصقة. بعد طي حواف النافذة تحت الصفاق ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الصفاق ، وادفع لأسفل على الصفاق باستخدام ملقط لتثبيته على النافذة.وبالمثل ، قم بإغلاق الصفاق عن طريق إيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية قبل دفع الجلد لأسفل ، ثم ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تمنع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة. لإدخال النافذة في البنكرياس ، ضع الماوس على وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، وقم بعمل شق على الجناح الأيسر قبل إزالة جزء من الصفاق كما هو موضح سابقا. باستخدام مسحات قطنية معقمة غارقة في محلول ملحي معقم ، اسحب الطحال بلطف لتصور البنكرياس.أعد وضع البنكرياس باستخدام مسحات القطن المبللة لجعل مساحة السطح مرئية من خلال الشق. بمجرد الوصول إلى البنكرياس ، أدخل وأغلق نافذة التصوير على المنطقة المطلوبة كما هو موضح من قبل. للوصول إلى الغدة الثديية ، ضع الماوس في وضع ضعيف ، وقم بعمل شق إنسي 10 ملليمتر إلى إحدى الحلمات الإربية باستخدام مقص وملقط معقم.قم بإزالة قسم مساحته 0.5 سنتيمتر مربع من الجلد فوق الغدة الثديية ، ثم افصل الغدة الثديية بلطف عن الجلد عن طريق نشر المقص المعقم بين السطحين لتعطيل الالتصاق. استخدم حقنة قياس 31 لتطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على سطح الغدة الثديية حول حواف المنطقة المراد تصويرها. ضع النافذة وأمسكها بإحكام ضد الغدة الثديية حتى تجف المادة اللاصقة.بعد طي حواف النافذة تحت الجلد ، قم بإيداع كمية صغيرة من المادة اللاصقة الجراحية على حواف النافذة الموجودة الآن تحت الجلد ، وادفع الجلد لأسفل باستخدام ملقط لتثبيت الجلد على النافذة. ضع الغراء حول حواف النافذة لإنشاء حافة تمنع الجلد من النمو مرة أخرى فوق النافذة. قبل البدء في جلسة التصوير ، قم بتنظيف النافذة من أي حطام متبقي عن طريق مسحها بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول.عند استخدام عدسة الغمر بالماء ، ضع هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة لتجنب الفقاعات. لبدء التصوير ، حدد موقع الشبكة ووضعها في التركيز من خلال المناظير. ثم حدد عمق تصوير الأنسجة التقريبي عن طريق تعيين الجزء السفلي من الشبكة إلى الصفر.ستساعد المعلومات في تحديد موقع المستوى Z المقابل في جلسات التصوير اللاحقة. لتحديد نفس الموقع عبر جلسات تصوير متعددة، استخدم المربعات الموجودة على الشبكة كنقطة مرجعية. أثناء جلسة التصوير، لاحظ اتجاه الشبكة وموقع كل مجال رؤية تم تصويره داخل الشبكة.يمكن استخدام الشبكة للانتقال مرة أخرى إلى مناطق شبكة محددة ومجالات تصوير في نجاح جلسات التصوير. بعد كل جلسة تصوير، قم بإزالة أي وسط غمر للعدسة المتبقية والحطام عن طريق مسح النافذة بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة في 70٪ من الإيثانول. تسمح نافذة السيليكون بالتقاط تسلل الخلايا المناعية الديناميكية بمرور الوقت.يوضح التحليل التمثيلي تسلل العدلات داخل أنسجة الغدة الثديية المعاد تشكيلها في اليومين الثاني والرابع. تسمح نافذة السيليكون بتصور الأورام في نقاط زمنية متعددة على مدار أسابيع بعد إدخال النافذة. النوافذ المصبوبة مع 200 ملليغرام من PDMS هي عموما أفضل للزرع الجراحي لأنها أظهرت صلابة أكبر بكثير من النوافذ المصبوبة مع 150 ملليغرام.تجدر الإشارة إلى أن نوافذ PDMS لم تكن صلبة مثل الزجاج القياسي ، ممثلة في معامل يونغ للنوافذ الزجاجية التي كانت أكبر بكثير من PDMS. كان إدخال النافذة في أعضاء مختلفة جيد التحمل حيث استمرت معظم الفئران في زيادة الوزن بمرور الوقت. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو إغلاق النافذة بالكامل باستخدام الغراء.هذا يمنع العدوى ، والأنسجة من الجفاف ، وإزاحة النافذة. بعد الإجراء ، يمكن إجراء الحقن التقويمي من خلال نافذة السيليكون ، مما يسمح للباحثين بدراسة مجموعة واسعة من الموضوعات ، مثل تكاثر الخلايا ، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية ، والفعالية العلاجية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

على المدى الطويل عالية الدقة حيوي داخلي المجهري في الرئة مع فراغ استقرت النافذة التصوير

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

وسرطان الخلايا مسانج ماوس نموذج الإنتقالية الكلوي لتقييم الكمي وطولية من قبل السريرية العلاج

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

الجينات مراسل fluorescence النويدات المشعة التصوير لتتبع تطور الورم في نماذج القوارض الورم

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

تقييم البيئة الدقيقة للورم من الانبثاث المدخل بوساطة الأوعية الدموية المرتبطة بنشر الخلايا السرطانية باستخدام التصوير داخل الحيوية وتحليل الأنسجة الثابتة

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

مقارنة النقيلي واضحة خلية الخلايا الكلوية نموذج سرطان الخلايا المنشأة في الكلى الماوس وعلى غشاء Chorioallantoic الدجاج

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

الوصول عبر الرادع إلى العلاج الكيميائي لمرضى سرطان الكبد

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

نمذجة الانبثاث الدماغ من خلال الحقن داخل الجمجمة والتصوير بالرنين المغناطيسي

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...