Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Vi takker Rob Eifert for hans hjælp med at designe og optimere de laserskårne gitter i rustfrit stål. Dette arbejde blev støttet af CSHL Cancer Center (P30-CA045508) og midler til ME fra National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 og 5P01CA013106-49); CSHL og Northwell Health; Thompson Family Foundation; Svøm over Amerika; og et tilskud fra Simons Foundation til CSHL. MS blev støttet af National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) og National Cancer Institute of the NIH under tildelingsnummer 1F30CA253993-01. L.M. er støttet af et James S. McDonnell Foundation Postdoc Fellowship. J.M.A. er modtager af et Cancer Research Institute / Irvington Postdoc Fellowship (CRI Award # 3435). D.A.T. er støttet af Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research og Thompson Family Foundation. Tegnefilm blev oprettet med Biorender.com.

Alle beskrevne procedurer blev udført i overensstemmelse med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines og var blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Støbning af silikonevinduet 
<ol><li>Silikonepolymeren (PDMS) fremstilles ved at blande baseelastomeren og hærdningsmidlet i forholdet 10:1 (v/v).</li>
	<li>Støbt et vindue ved at deponere en lille mængde PDMS på en steril, glat overflade og juster volum...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravitale billeddannelsesvinduer er vigtige værktøjer til direkte visualisering af fysiologiske og patologiske processer ved cellulær opløsning, når de udfolder sig over tid. Den nye procedure, der er beskrevet for støbning og indsættelse af fleksible silikonebilleddannelsesvinduer i mus, overvinder nogle af de mest almindelige problemer med aktuelt anvendte billedvinduer (ekssudat, brud og interferens med normal mobilitet), giver yderligere sikkerhed for musen og øger tilgængeligheden af denne teknik.
<p ...

Intravital mikroskopi (IVM), billeddannelse af væv hos anæstesiiserede dyr, giver indsigt i dynamikken i fysiologiske og patologiske hændelser ved cellulær opløsning i intakte væv. Anvendelserne af denne teknik varierer meget, men IVM har været medvirkende til kræftbiologiområdet for at hjælpe med at belyse, hvordan kræftceller invaderer væv og metastaserer, interagerer med det omgivende mikromiljø og reagerer på lægemidler 1,2,3. Derudover har IVM været nøglen til at fremme forståelsen af de komplekse mekanismer, der styrer immunresponser ved at give indsigt, der supplerer ex vivo-profileringsmetoder (f.eks. Flowcytometri). For eksempel har intravitale billeddannelseseksperimenter afsløret detaljer om immunfunktioner, da de vedrører cellemigration og celle-cellekontakt og har tilbudt en platform til at kvantificere spatiotemporal dynamik som reaktion på skade eller infektion 4,5,6,7. Mange af disse processer kan også studeres gennem histologisk farvning, men kun IVM tillader sporing af dynamiske ændringer. Faktisk, mens en histologisk sektion giver et øjebliksbillede af vævet på et givet tidspunkt, kan intravital billeddannelse spore intercellulære og subcellulære begivenheder inden for det samme væv over tid. Især fremskridt inden for fluorescensmærkning og udvikling af molekylære reportere har gjort det muligt at korrelere molekylære hændelser med cellulær adfærd, såsom proliferation, død, bevægelighed og interaktion med andre celler eller den ekstracellulære matrix. De fleste IVM-teknikker er baseret på fluorescensmikroskopi, hvilket på grund af lysspredning gør billeddannelse af dybere væv udfordrende. Vævet af interesse skal derfor ofte udsættes kirurgisk med en ofte invasiv og terminal procedure. Afhængigt af organstedet kan vævet således afbildes kontinuerligt i en periode, der varierer fra nogle få til 40 timer8. Alternativt tillader den kirurgiske indsættelse af et permanent billeddannelsesvindue billeddannelse af det samme væv sekventielt over en periode på dage til uge 7,9.
Udviklingen af nye billedbehandlingsvinduer er blevet fremhævet som et teknologisk behov for yderligere at forbedre intravital billeddannelsesmetoder10. Det prototypiske intravitale billeddannelsesvindue er en metalring, der indeholder et glasdæksler, der er fastgjort til huden med suturer11. Indgreb i den frie bevægelighed, ophobning af ekssudat og beskadigelse af glasdæksedlen er almindelige problemer, der ses ved brug af sådanne vinduer. Desuden kræver det prototypiske vindue specialiseret produktion, og den kirurgiske procedure kan kræve omfattende træning. For at løse disse problemer blev polydimethylsiloxan (PDMS), en silikonepolymer, som tidligere har været anvendt i kranievinduer til langvarig billeddannelse i hjernen12, tilpasset til brug i abdominal organ- og brystkirtelbilleddannelse. Her præsenteres en detaljeret metode til generering af PDMS-baserede silikonevinduer, herunder hvordan man støber vinduet rundt om et rustfrit stålgitter for at give landemærker til gentagen billeddannelse af de samme vævsområder. Desuden beskrives en simpel, stingfri kirurgisk procedure til indsættelse af vinduet over abdominale organer eller brystkirtlen. Denne nye tilgang overvinder nogle af de mest almindelige problemer med aktuelt anvendte billedvinduer og øger tilgængeligheden af langsgående intravital billeddannelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

Intravital mikroskopi (IVM) muliggør visualisering af cellebevægelse, deling og død ved enkeltcelleopløsning. IVM gennem kirurgisk indsatte billedvinduer er særligt kraftfuldt, fordi det tillader langsgående observation af det samme væv over dage til uger. Typiske billedvinduer består af et glasdæksler i en biokompatibel metalramme sutureret til musens hud. Disse vinduer kan forstyrre musenes frie bevægelighed, fremkalde en stærk inflammatorisk reaktion og mislykkes på grund af knust glas eller revne suturer, hvoraf nogen kan nødvendiggøre eutanasi. For at løse disse problemer blev vinduer til langsigtet abdominal organ- og brystkirtelbilleddannelse udviklet fra en tynd film af polydimethylsiloxan (PDMS), en optisk klar silikonepolymer, der tidligere blev brugt til kraniale billeddannelsesvinduer. Disse vinduer kan limes direkte på vævene, hvilket reducerer den tid, der er nødvendig for indsættelse. PDMS er fleksibelt og bidrager til dets holdbarhed hos mus over tid - op til 35 dage er blevet testet. Langsgående billeddannelse er billeddannelse af det samme vævsområde under separate sessioner. Et gitter i rustfrit stål blev indlejret i vinduerne for at lokalisere det samme område, hvilket tillod visualisering af dynamiske processer (som brystkirtelindvikulation) på de samme steder med dages mellemrum. Dette silikonevindue tillod også overvågning af enkeltformidlede kræftceller, der udviklede sig til mikrometastaser over tid. Silikonevinduerne, der anvendes i denne undersøgelse, er enklere at indsætte end metalindrammede glasvinduer og forårsager begrænset betændelse i det afbildede væv. Desuden giver indlejrede gitre mulighed for ligetil sporing af den samme vævsregion i gentagne billeddannelsessessioner.

Intravital billeddannelse gennem billeddannelsesvinduer kan bruges til at observere, spore og kvantificere en bred vifte af cellulære og molekylære hændelser ved enkeltcelleopløsning over en periode på timer til uger. Ideelle funktioner til et billedvindue omfatter: a) begrænset indvirkning på musens trivsel og vævets fysiologi; b) holdbarhed c) enkelhed ved indsættelse og d) klare landemærker for gentagen billeddannelse af den samme region. Resultatet er et alsidigt, inert silikonevindue, der let kan producere...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

En tilgang præsenteres her til langsigtet intravital billeddannelse ved hjælp af optisk klare silikonevinduer, der kan limes direkte på vævet / organet af interesse og huden. Disse vinduer er billigere og mere alsidige end andre, der i dag anvendes i marken, og den kirurgiske indsættelse forårsager begrænset betændelse og angst for dyrene.

Langsgående intravital billeddannelse gennem klare silikonevinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Denne procedure til støbning og indsættelse af silikonevinduer sænker de tekniske barrierer for langsgående intravital billeddannelse. Vores protokol producerer robuste, let tilpasningsdygtige vinduer, der tolereres godt af dyrene. Ved hjælp af denne teknik har vi afbildet kræft og immunceller i leveren, bugspytkirtlen og brystkirtlen.Med minimale justeringer kunne den tilpasses mange anatomiske placeringer og biologiske spørgsmål. For dem, der prøver denne teknik for første gang, skal du øve dig i at frigive små mængder lim fra sprøjten. Påføring af for meget lim vil skygge for billedfeltet og gøre det kirurgiske område vanskeligt at arbejde med.Begynd at støbe silikonevinduet ved at deponere en lille mængde af den frisklavede silikonepolymer, polydimethylsiloxan, af PDMS, på en ren glat overflade, og juster forholdet mellem volumen og areal for at få den ønskede tykkelse. Når PDMS er deponeret på den ønskede støbeoverflade, skal du let trykke et gitter i rustfrit stål ind i silikonen for at give landemærker til gentagen billeddannelse af de samme vævsområder. For at fjerne luftboblerne og afgasse silikonepolymeren skal du placere den belagte overflade i en vakuumtørrer i 45 minutter.Når du er færdig, hærder polymeren i en ovn ved 75 til 80 grader Celsius i 45 minutter. Scor polymeren ved formens kanter, og brug tang til forsigtigt at skrælle de hærdede vinduer fra overfladen, der bruges til støbning. Placer musen på venstre laterale decubitusposition.Forbered den anæstetiserede mus til kirurgi ved at anvende 10% volumen for volumen povidon jodopløsning og 70% volumen i volumen ethanol tre gange i træk på det barberede kirurgiske sted. Der skal udvises forsigtighed for at opretholde et sterilt kirurgisk felt. Brug derefter steril saks og tang til at lave et 10 millimeter snit på højre flanke på tre millimeter under kostalbuen.Fjern en kvadratcentimeter del af huden og brug et andet par sterile saks og tang til at fjerne en del af bughinden, der er lidt mindre end sektionen af huden. Deponer en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på en steril brøndplade og træk den ud med en 31 gauge sprøjte, der skal påføres på leverens overflade omkring kanterne af det område, der skal afbildes, placer derefter vinduet på det ønskede område, og hold det fast mod leveren i cirka to minutter, indtil klæbemidlet er tørret. Efter foldning af vinduets kanter under bughinden deponeres en lille mængde af det kirurgiske klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under bughinden, skal du skubbe ned på bughinden med tang for at fastgøre det til vinduet.På samme måde skal du forsegle bughinden ved at deponere en lille mængde af det kirurgiske klæbemiddel, inden du skubber huden ned, og påfør derefter lim rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der forhindrer huden i at vokse tilbage over vinduet. For at indsætte vinduet i bugspytkirtlen skal du placere musen på højre laterale decubitusposition og foretage snittet på venstre flanke, før du fjerner en del af bughinden som vist tidligere. Ved hjælp af sterile bomuldspindler gennemblødt med sterilt saltvand, trak forsigtigt milten for at visualisere bugspytkirtlen.Flyt bugspytkirtlen med de fugtede vatpinde for at gøre mere overfladeareal synligt gennem snittet. Når bugspytkirtlen er tilgængelig, skal du indsætte og forsegle billedvinduet på det ønskede område som forklaret før. For at få adgang til brystkirtlen skal du placere musen i liggende stilling og lave et 10 millimeter snit medialt til en af de inguinale brystvorter ved hjælp af steril saks og tang.Fjern en 0,5 kvadratcentimeter sektion af huden over brystkirtlen, og adskil derefter forsigtigt brystkirtlen fra huden ved at sprede den sterile saks mellem de to overflader for at forstyrre vedhæftningen. Brug en 31 gauge sprøjte til at påføre en lille mængde af det kirurgiske klæbemiddel på overfladen af brystkirtlen omkring kanterne af det område, der skal afbildes. Placer og hold vinduet fast mod brystkirtlen, indtil klæbemidlet tørrer.Efter foldning af vinduets kanter under huden skal du deponere en lille mængde kirurgisk klæbemiddel på kanterne af vinduet, der nu er under huden, og skubbe ned på huden med tang for at fastgøre huden til vinduet. Påfør limen rundt om vinduets kanter for at skabe en kant, der forhindrer huden i at vokse tilbage over vinduet. Før du begynder billedbehandlingen, skal du rense vinduet for resterende snavs ved forsigtigt at tørre det af med en vatpind dyppet i 70% ethanol.Når du bruger en vandnedsænkningslinse, skal du anvende ultralydsgelen på vinduet og undgå bobler. For at starte billeddannelsen skal du lokalisere og placere gitteret i fokus gennem kikkerten. Bestem derefter den omtrentlige vævsbilleddybde ved at indstille bunden af gitteret til nul.Oplysningerne hjælper med at lokalisere det tilsvarende Z-plan i efterfølgende billeddannelsessessioner. Hvis du vil identificere den samme placering over flere billedbehandlingssessioner, skal du bruge firkanterne på gitteret som referencepunkt. Under billedbehandlingen skal du notere gitterretningen og placeringen af hvert visningsfelt, der er afbildet i gitteret.Gitteret kan bruges til at navigere tilbage til bestemte gitterområder og billedfelter i succesen med billedbehandlingssessioner. Efter hver billedbehandling skal du fjerne eventuelle resterende linsenedsænkningsmedier og snavs ved forsigtigt at tørre vinduet af med en vatpind dyppet i 70% ethanol. Silikonevinduet gør det muligt at fange den dynamiske immuncelleinfiltration over tid.Den repræsentative analyse illustrerer neutrofilinfiltrationen i det ombyggende brystkirtelvæv på dag to og fire. Silikonevinduet gør det muligt at visualisere tumorer på flere tidspunkter over uger efter vinduesindsættelse. Vinduerne støbt med 200 milligram PDMS er generelt bedre til kirurgisk implantation, da de udviste signifikant større sejhed end vinduerne støbt med 150 milligram.Bemærk, at PDMS-vinduerne ikke var så stive som standardglas, repræsenteret ved, at Youngs modul af glasvinduerne var betydeligt større end PDMS. Vinduesindsættelsen i forskellige organer var veltolereret, da de fleste mus fortsatte med at tage på i vægt over tid. Den vigtigste ting at huske, når du forsøger denne procedure, er at forsegle vinduet fuldt ud ved hjælp af lim.Dette forhindrer infektion, vævet i at tørre ud og forskydningen af vinduet. Efter proceduren kan ortotopiske injektioner udføres gennem silikonevinduet, så forskere kan studere en lang række emner, såsom celleproliferation, celle-celleinteraktioner og terapeutisk effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsigtet High-Resolution Intravital Mikroskopi i Lung med en Vacuum Stabiliseret Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngen musemodel af metastaserende renalcellecarcinom for Kvantitativ og Longitudinal Vurdering af Prækliniske Terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Vurdering tumor mikromiljø af metastase døråbning-medieret vaskulær permeabilitet forbundet med kræft celle udbredelse ved hjælp af Intravital Imaging og fast vævsanalyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Sammenligning metastatisk klar celle renal celle karcinom model etableret i mus nyre og på Kylling Chorioallantoic Membran

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradial Adgang Chemoembolization for Hepatocellulære Carcinoma Patienter

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellering Brain Metastaser gennem intrakraniel injektion og magnetisk resonans Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Opdagelsen af metastatiske regulatorer ved hjælp af en hurtig og kvantitativ intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...