Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Wij danken Rob Eifert voor zijn hulp bij het ontwerpen en optimaliseren van de lasergesneden rvs roosters. Dit werk werd ondersteund door het CSHL Cancer Center (P30-CA045508) en fondsen voor ME van de National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 en 5P01CA013106-49); CSHL en Northwell Health; de Thompson Family Foundation; Zwem door Amerika; en een subsidie van de Simons Foundation aan CSHL. MS werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) en het National Cancer Institute van de NIH onder toekenningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. wordt ondersteund door een James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. is de ontvanger van een Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wordt ondersteund door de Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research en de Thompson Family Foundation. Cartoons werden gemaakt met Biorender.com.

Alle beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de chirurgische richtlijnen van het Cold Spring Harbor Laboratory en waren goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Het siliconen venster gieten 
<ol><li>Bereid het siliconenpolymeer (PDMS) door het basiselastomeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 (v/v) te mengen.</li>
	<li>Giet een raam door een kleine hoeveelheid PDMS op e...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravitale beeldvormingsvensters zijn belangrijke hulpmiddelen voor het direct visualiseren van fysiologische en pathologische processen met cellulaire resolutie terwijl ze zich in de loop van de tijd ontvouwen. De nieuwe procedure die wordt beschreven voor het gieten en invoegen van flexibele, siliconenbeeldvormingsvensters bij muizen overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte afbeeldingsvensters (exsudaat, breken en interferentie met normale mobiliteit), biedt extra veiligheid voor de m...

Intravitale microscopie (IVM), de beeldvorming van weefsels bij verdoofde dieren, biedt inzicht in de dynamiek van fysiologische en pathologische gebeurtenissen bij cellulaire resolutie in intacte weefsels. De toepassingen van deze techniek variëren sterk, maar IVM heeft een belangrijke rol gespeeld op het gebied van kankerbiologie om te helpen ophelderen hoe kankercellen weefsels binnendringen en uitzaaien, interageren met de omliggende micro-omgeving en reageren op geneesmiddelen 1,2,3. Bovendien is IVM de sleutel geweest tot het bevorderen van het begrip van de complexe mechanismen die immuunresponsen beheersen door inzichten te bieden die complementair zijn aan ex vivo profileringsbenaderingen (bijv. Flowcytometrie). Intravitale beeldvormingsexperimenten hebben bijvoorbeeld details onthuld over immuunfuncties als ze betrekking hebben op celmigratie en cel-celcontact en hebben een platform geboden om spatiotemporale dynamica te kwantificeren als reactie op letsel of infectie 4,5,6,7. Veel van deze processen kunnen ook worden bestudeerd door histologische kleuring, maar alleen IVM maakt het mogelijk om dynamische veranderingen te volgen. In feite, terwijl een histologische sectie een momentopname van het weefsel op een bepaald moment biedt, kan intravitale beeldvorming intercellulaire en subcellulaire gebeurtenissen in hetzelfde weefsel in de loop van de tijd volgen. Met name de vooruitgang in fluorescentielabeling en de ontwikkeling van moleculaire reporters hebben het mogelijk gemaakt moleculaire gebeurtenissen te correleren met cellulair gedrag, zoals proliferatie, dood, beweeglijkheid en interactie met andere cellen of de extracellulaire matrix. De meeste IVM-technieken zijn gebaseerd op fluorescentiemicroscopie, wat vanwege lichtverstrooiing het afbeelden van diepere weefsels een uitdaging maakt. Het weefsel van belang moet daarom vaak chirurgisch worden blootgesteld met een vaak invasieve en terminale procedure. Afhankelijk van de plaats van het orgaan kan het weefsel dus continu worden afgebeeld gedurende een periode variërend van enkele tot 40 h8. Als alternatief maakt het chirurgisch inbrengen van een permanent beeldvormingsvenster de beeldvorming van hetzelfde weefsel sequentieel mogelijk gedurende een periode van dagen tot week 7,9.
De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingsvensters is benadrukt als een technologische noodzaak om intravitale beeldvormingsbenaderingen verder te verbeteren10. Het prototypische intravitale beeldvormingsvenster is een metalen ring met een glazen dekplaat die met hechtingen aan de huid is bevestigd11. Interferentie met vrije beweging, de accumulatie van exsudaat en schade aan de glazen afdekkingslip zijn veel voorkomende problemen bij het gebruik van dergelijke ramen. Bovendien vereist het prototypische venster gespecialiseerde productie en kan de chirurgische procedure uitgebreide training vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werd polydimethylsiloxaan (PDMS), een siliconenpolymeer, dat eerder is gebruikt in schedelvensters voor langetermijnbeeldvorming in de hersenen12, aangepast voor gebruik in beeldvorming van buikorganen en borstklieren. Hier wordt een gedetailleerde methode gepresenteerd voor het genereren van op PDMS gebaseerde siliconenvensters, inclusief hoe het venster rond een roestvrijstalen raster kan worden gegoten om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Verder wordt een eenvoudige, steekvrije chirurgische ingreep beschreven voor het inbrengen van het venster boven buikorganen of de borstklier. Deze nieuwe aanpak overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte beeldvormingsvensters en verhoogt de toegankelijkheid van longitudinale intravitale beeldvorming.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

Intravitale microscopie (IVM) maakt visualisatie van celbeweging, deling en dood mogelijk bij eencellige resolutie. IVM via chirurgisch ingebrachte beeldvormingsvensters is bijzonder krachtig omdat het longitudinale observatie van hetzelfde weefsel gedurende dagen tot weken mogelijk maakt. Typische beeldvormingsvensters bestaan uit een glazen afdekplaat in een biocompatibel metalen frame dat aan de huid van de muis is gehecht. Deze vensters kunnen de vrije beweging van de muizen verstoren, een sterke ontstekingsreactie uitlokken en falen als gevolg van gebroken glas of gescheurde hechtingen, die allemaal euthanasie kunnen vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werden vensters voor beeldvorming van buikorganen en borstklieren op lange termijn ontwikkeld uit een dunne film van polydimethylsiloxaan (PDMS), een optisch helder siliconenpolymeer dat eerder werd gebruikt voor craniale beeldvormingsvensters. Deze vensters kunnen rechtstreeks op de weefsels worden gelijmd, waardoor de tijd die nodig is voor het inbrengen wordt verkort. PDMS is flexibel en draagt bij aan de duurzaamheid bij muizen in de loop van de tijd - tot 35 dagen zijn getest. Longitudinale beeldvorming is beeldvorming van hetzelfde weefselgebied tijdens afzonderlijke sessies. Een roestvrijstalen rooster werd ingebed in de ramen om hetzelfde gebied te lokaliseren, waardoor dynamische processen (zoals involutie van de melkklier) op dezelfde locaties, dagen na elkaar, konden worden gevisualiseerd. Dit siliconenvenster maakte het ook mogelijk om afzonderlijke verspreide kankercellen te volgen die zich in de loop van de tijd ontwikkelen tot micrometastasen. De siliconen ramen die in deze studie worden gebruikt, zijn eenvoudiger in te brengen dan glazen ramen met een metalen frame en veroorzaken een beperkte ontsteking van de afgebeelde weefsels. Bovendien maken ingebedde rasters het mogelijk om hetzelfde weefselgebied eenvoudig te volgen in herhaalde beeldvormingssessies.

Intravitale beeldvorming door middel van beeldvormingsvensters kan worden gebruikt om een breed scala aan cellulaire en moleculaire gebeurtenissen met eencellige resolutie over een periode van uren tot weken te observeren, te volgen en te kwantificeren. Ideale kenmerken voor een beeldvormingsvenster zijn: a) beperkte impact op het welzijn van de muis en de fysiologie van het weefsel; b) duurzaamheid; c) eenvoud van inbrengen; en d) duidelijke oriëntatiepunten voor herhaalde beeldvorming van hetzelfde gebied. Het resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Deze procedure voor het gieten en inbrengen van siliconen ramen verlaagt de technische barrières voor longitudinale intravitale beeldvorming. Ons protocol produceert stevige, gemakkelijk aanpasbare ramen die goed worden verdragen door de dieren. Met behulp van deze techniek hebben we kanker en immuuncellen in de lever, alvleesklier en borstklier in beeld gebracht.Met minimale aanpassingen kon het worden aangepast aan vele anatomische locaties en biologische vragen. Voor degenen die deze techniek voor de eerste keer proberen, oefen met het vrijgeven van kleine hoeveelheden lijm uit de spuit. Het aanbrengen van te veel lijm zal het beeldvormingsveld vertroebelen en het operatiegebied moeilijk maken om mee te werken.Begin met het gieten van het siliconenvenster door een kleine hoeveelheid van het vers bereide siliconenpolymeer, polydimethylsiloxaan, van PDMS, op een schoon glad oppervlak te deponeren en pas de verhouding tussen volume en oppervlakte aan om de gewenste dikte te krijgen. Zodra het PDMS op het gewenste gietoppervlak is afgezet, drukt u lichtjes op een roestvrijstalen rooster in de siliconen om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Om de luchtbellen te verwijderen en het siliconenpolymeer te ontgassen, plaatst u het gecoate oppervlak gedurende 45 minuten in een vacuümsiccator.Als je klaar bent, laat je het polymeer in een oven uitharden op 75 tot 80 graden Celsius gedurende 45 minuten. Scoor het polymeer aan de randen van de mal en gebruik een tang om de uitgeharde ramen voorzichtig af te pellen van het oppervlak dat wordt gebruikt voor het gieten. Plaats de muis op de linker zijwaartse decubituspositie.Bereid de verdoofde muis voor op een operatie door 10% volume povidon jodiumoplossing en 70% volume volume ethanol driemaal achter elkaar op de geschoren operatieplaats aan te brengen. Er moet voor worden gezorgd dat een steriel chirurgisch veld wordt onderhouden. Gebruik vervolgens een steriele schaar en tang om een incisie van 10 millimeter te maken op de rechterflank op drie millimeter onder de ribbenboog.Verwijder een deel van de huid van één vierkante centimeter en gebruik een tweede steriele schaar en tang om een deel van het peritoneum te verwijderen dat iets kleiner is dan het deel van de huid. Deponeer een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op een steriele putplaat en trek deze op met een spuit van 31 gauge om op het oppervlak van de lever rond de randen van het af te beelden gebied aan te brengen, plaats vervolgens het venster op het gewenste gebied en houd het stevig tegen de lever gedurende ongeveer twee minuten totdat de lijm is opgedroogd. Na het vouwen van de randen van het raam onder het peritoneum deponeert u een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm op de randen van het raam die zich nu onder het peritoneum bevinden, drukt u met een tang op het peritoneum om het aan het raam te bevestigen.Sluit op dezelfde manier het peritoneum af door een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm af te zetten voordat u de huid naar beneden duwt en breng vervolgens lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die voorkomt dat de huid teruggroeit over het raam. Om het venster in de alvleesklier in te brengen, plaatst u de muis op de rechter laterale decubituspositie en maakt u de incisie op de linkerflank voordat u een deel van het peritoneum verwijdert zoals eerder is aangetoond. Met behulp van steriele wattenstaafjes gedrenkt in steriele zoutoplossing, trok voorzichtig aan de milt om de alvleesklier te visualiseren.Verplaats de alvleesklier met de bevochtigde wattenstaafjes om meer oppervlak zichtbaar te maken door de incisie. Zodra de alvleesklier toegankelijk is, plaatst en verzegelt u het beeldvormingsvenster op het gewenste gebied zoals eerder uitgelegd. Om toegang te krijgen tot de borstklier, plaatst u de muis in rugligging en maakt u een mediale incisie van 10 millimeter in een van de lieshalzen met behulp van een steriele schaar en tang.Verwijder een gedeelte van 0,5 vierkante centimeter van de huid boven de borstklier en scheid vervolgens voorzichtig de borstklier van de huid door de steriele schaar tussen de twee oppervlakken te verspreiden om de hechting te verstoren. Gebruik een spuit van 31 gauge om een kleine hoeveelheid van de chirurgische lijm aan te brengen op het oppervlak van de borstklier rond de randen van het in beeld te brengen gebied. Plaats en houd het raam stevig tegen de borstklier totdat de lijm droogt.Nadat u de randen van het venster onder de huid hebt gevouwen, deponeert u een kleine hoeveelheid chirurgische lijm op de randen van het venster die zich nu onder de huid bevinden en drukt u met een tang op de huid om de huid aan het raam te bevestigen. Breng de lijm aan rond de randen van het venster om een rand te creëren die voorkomt dat de huid teruggroeit over het raam. Voordat u aan de beeldvormingssessie begint, reinigt u het raam van achtergebleven vuil door het voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol.Wanneer u een onderdompelingslens in water gebruikt, brengt u de ultrasone gel aan op het venster om bubbels te vermijden. Om de beeldvorming te starten, lokaliseer en plaats het raster in focus door de oculairen. Bepaal vervolgens de geschatte weefselbeeldvormingsdiepte door de onderkant van het raster op nul te zetten.De informatie zal helpen bij het lokaliseren van het overeenkomstige Z-vlak in volgende beeldvormingssessies. Als u dezelfde locatie wilt identificeren tijdens meerdere beeldbewerkingssessies, gebruikt u de vierkanten op het raster als referentiepunt. Noteer tijdens de beeldbewerkingssessie de rasteroriëntatie en de locatie van elk gezichtsveld dat binnen het raster wordt afgebeeld.Het raster kan worden gebruikt om terug te navigeren naar specifieke rastergebieden en beeldvormingsvelden in het succes van beeldvormingssessies. Verwijder na elke opnamesessie het resterende onderdompelingsmedium en vuil van de lens door het raam voorzichtig af te vegen met een wattenstaafje gedompeld in 70% ethanol. Het siliconenvenster maakt het mogelijk om de dynamische infiltratie van immuuncellen in de loop van de tijd vast te leggen.De representatieve analyse illustreert de neutrofiele infiltratie in het remodellererende borstklierweefsel op dag twee en vier. Het siliconenvenster maakt het mogelijk tumoren op meerdere tijdstippen te visualiseren gedurende weken na het inbrengen van het venster. De ramen gegoten met 200 milligram PDMS zijn over het algemeen beter voor chirurgische implantatie omdat ze een aanzienlijk grotere taaiheid vertoonden dan de ramen gegoten met 150 milligram.Van belang is dat de PDMS-ramen niet zo stijf waren als standaard glas, vertegenwoordigd door de Modulus van de Young van de glazen ramen die aanzienlijk groter waren dan PDMS. Het inbrengen van het venster in verschillende organen werd goed verdragen omdat de meeste muizen in de loop van de tijd bleven aankomen. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om het raam volledig af te dichten met lijm.Dit voorkomt infectie, het uitdrogen van het weefsel en de verplaatsing van het raam. Na de procedure kunnen orthotopische injecties worden gedaan via het siliconenvenster, waardoor onderzoekers een breed scala aan onderwerpen kunnen bestuderen, zoals celproliferatie, cel-celinteracties en therapeutische werkzaamheid.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradiale toegang chemoembolisatie voor hepatocellulair carcinoom patiënten

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellering van hersenmetastasen door middel van intracraniale injectie en magnetische resonantie beeldvorming

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...