Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Nous remercions Rob Eifert pour son aide dans la conception et l’optimisation des grilles en acier inoxydable découpées au laser. Ce travail a été soutenu par le CSHL Cancer Center (P30-CA045508) et des fonds pour M.E. des National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 et 5P01CA013106-49); CSHL et Northwell Health; la Fondation de la famille Thompson; Nager à travers l’Amérique; et une subvention de la Fondation Simons à CSHL. M.S. a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) et le National Cancer Institute du NIH sous le numéro d’attribution 1F30CA253993-01. L.M. est soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation James S. McDonnell. J.M.A. est récipiendaire d’une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le cancer et Irvington (Prix CRI no 3435). D.A.T. est soutenu par le Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research et la Thompson Family Foundation. Les dessins animés ont été créés avec Biorender.com.

Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux directives chirurgicales du laboratoire de Cold Spring Harbor et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du laboratoire de Cold Spring Harbor.
1. Coulée de la fenêtre en silicone 
<ol><li>Préparez le polymère de silicone (PDMS) en mélangeant l’élastomère de base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 (v / v).</li>
	<li>Coulez une...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Les fenêtres d’imagerie intravitale sont des outils importants pour visualiser directement les processus physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire au fur et à mesure qu’ils se déroulent au fil du temps. La nouvelle procédure décrite pour la coulée et l’insertion de fenêtres d’imagerie flexibles en silicone chez la souris surmonte certains des problèmes les plus courants avec les fenêtres d’imagerie actuellement utilisées (exsudat, rupture et interférence avec la mobilité normale),...

La microscopie intravitale (MIV), l’imagerie des tissus chez les animaux anesthésiés, offre un aperçu de la dynamique des événements physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire dans les tissus intacts. Les applications de cette technique varient considérablement, mais la MIV a joué un rôle déterminant dans le domaine de la biologie du cancer pour aider à élucider comment les cellules cancéreuses envahissent les tissus et métastasent, interagissent avec le microenvironnement environnant et répondent aux médicaments 1,2,3. En outre, la MIV a joué un rôle clé dans la compréhension des mécanismes complexes régissant les réponses immunitaires en fournissant des informations complémentaires aux approches de profilage ex vivo (par exemple, cytométrie en flux). Par exemple, des expériences d’imagerie intravitale ont révélé des détails sur les fonctions immunitaires en ce qui concerne la migration cellulaire et le contact cellule-cellule et ont offert une plate-forme pour quantifier la dynamique spatio-temporelle en réponse à une blessure ou à une infection 4,5,6,7. Beaucoup de ces processus peuvent également être étudiés par coloration histologique, mais seule la MIV permet le suivi des changements dynamiques. En fait, alors qu’une section histologique offre un instantané du tissu à un moment donné, l’imagerie intravitale peut suivre les événements intercellulaires et subcellulaires au sein du même tissu au fil du temps. En particulier, les progrès dans le marquage de fluorescence et le développement de rapporteurs moléculaires ont permis de corréler les événements moléculaires avec les comportements cellulaires, tels que la prolifération, la mort, la motilité et l’interaction avec d’autres cellules ou la matrice extracellulaire. La plupart des techniques de MIV sont basées sur la microscopie à fluorescence, ce qui, en raison de la diffusion de la lumière, rend l’imagerie des tissus plus profonds difficile. Le tissu d’intérêt doit donc souvent être exposé chirurgicalement avec une procédure souvent invasive et terminale. Ainsi, selon le site de l’organe, le tissu peut être imagé en continu pendant une période variant de quelques-uns à 40 h8. Alternativement, l’insertion chirurgicale d’une fenêtre d’imagerie permanente permet l’imagerie séquentielle du même tissu sur une période de jours àsemaines 7,9.
Le développement de nouvelles fenêtres d’imagerie a été mis en évidence comme un besoin technologique pour améliorer encore les approches d’imagerie intravitale10. La fenêtre d’imagerie intravitale prototypique est un anneau métallique contenant un couvercle en verre fixé à la peau avec des sutures11. L’interférence avec la libre circulation, l’accumulation d’exsudat et les dommages à la glissière de couverture en verre sont des problèmes courants observés lors de l’utilisation de telles fenêtres. De plus, la fenêtre prototypique nécessite une production spécialisée et la procédure chirurgicale peut nécessiter une formation approfondie. Pour résoudre ces problèmes, le polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone, qui a déjà été utilisé dans les fenêtres crâniennes pour l’imagerie à long terme dans le cerveau12, a été adapté pour une utilisation dans l’imagerie des organes abdominaux et des glandes mammaires. Ici, une méthode détaillée pour générer des fenêtres en silicone à base de PDMS est présentée, y compris comment couler la fenêtre autour d’une grille en acier inoxydable pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. En outre, une procédure chirurgicale simple et sans couture pour insérer la fenêtre sur les organes abdominaux ou la glande mammaire est décrite. Cette nouvelle approche permet de surmonter certains des problèmes les plus courants liés aux fenêtres d’imagerie actuellement utilisées et d’accroître l’accessibilité de l’imagerie intravitale longitudinale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

La microscopie intravitale (MIV) permet de visualiser le mouvement, la division et la mort des cellules à une résolution unicellulaire. La MIV à travers des fenêtres d’imagerie insérées chirurgicalement est particulièrement puissante car elle permet l’observation longitudinale du même tissu sur des jours ou des semaines. Les fenêtres d’imagerie typiques comprennent un couvercle en verre dans un cadre métallique biocompatible suturé à la peau de la souris. Ces fenêtres peuvent interférer avec la libre circulation des souris, provoquer une forte réponse inflammatoire et échouer en raison de bris de verre ou de sutures déchirées, dont l’une peut nécessiter une euthanasie. Pour résoudre ces problèmes, des fenêtres pour l’imagerie à long terme des organes abdominaux et des glandes mammaires ont été développées à partir d’un film mince de polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone optiquement clair précédemment utilisé pour les fenêtres d’imagerie crânienne. Ces fenêtres peuvent être collées directement sur les tissus, ce qui réduit le temps nécessaire à l’insertion. Le PDMS est flexible, contribuant à sa durabilité chez la souris au fil du temps – jusqu’à 35 jours ont été testés. L’imagerie longitudinale est l’imagerie de la même région tissulaire au cours de séances distinctes. Une grille en acier inoxydable a été intégrée dans les fenêtres pour localiser la même région, permettant la visualisation de processus dynamiques (comme l’involution des glandes mammaires) aux mêmes endroits, à quelques jours d’intervalle. Cette fenêtre en silicone a également permis de surveiller les cellules cancéreuses disséminées uniques se développant en micro-métastases au fil du temps. Les fenêtres en silicone utilisées dans cette étude sont plus simples à insérer que les fenêtres en verre à cadre métallique et provoquent une inflammation limitée des tissus imagés. De plus, les grilles intégrées permettent un suivi simple de la même région tissulaire lors de séances d’imagerie répétées.

L’imagerie intravitale via des fenêtres d’imagerie peut être utilisée pour observer, suivre et quantifier un large éventail d’événements cellulaires et moléculaires à une résolution unicellulaire sur une période de plusieurs heures à quelques semaines. Les caractéristiques idéales pour une fenêtre d’imagerie comprennent: a) un impact limité sur le bien-être de la souris et la physiologie du tissu; b) la durabilité; c) simplicité d’insertion; et d) des repères clairs pour l’imagerie répét?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Cette procédure de coulée et d’insertion de fenêtres en silicone abaisse les barrières techniques à l’imagerie intravitale longitudinale. Notre protocole produit des fenêtres robustes, facilement adaptables et bien tolérées par les animaux. En utilisant cette technique, nous avons imagé le cancer et les cellules immunitaires dans le foie, le pancréas et la glande mammaire.Avec un minimum d’ajustements, il pourrait être adapté à de nombreux emplacements anatomiques et questions biologiques. Pour ceux qui essaient cette technique pour la première fois, entraînez-vous à libérer de petites quantités de colle de la seringue. L’application de trop de colle obscurcira le champ d’imagerie et rendra la zone chirurgicale difficile à travailler.Commencez à couler la fenêtre en silicone en déposant une petite quantité de polymère de silicone fraîchement préparé, le polydiméthylsiloxane, de PDMS, sur une surface lisse et propre, et ajustez le rapport volume/surface pour obtenir l’épaisseur souhaitée. Une fois que le PDMS est déposé sur la surface de coulée souhaitée, appuyez légèrement sur une grille en acier inoxydable dans le silicone pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. Pour éliminer les bulles d’air et dégazer le polymère de silicone, placez la surface revêtue dans un dessiccateur sous vide pendant 45 minutes.Une fois terminé, durcissez le polymère dans un four à 75 à 80 degrés Celsius pendant 45 minutes. Marquez le polymère sur les bords du moule et utilisez des pinces pour décoller doucement les fenêtres durcies de la surface utilisée pour la coulée. Placez la souris sur la position latérale gauche du décubitus.Préparer la souris anesthésiée à la chirurgie en appliquant 10% volume par volume de solution d’iode de povidone et 70% volume par volume d’éthanol trois fois consécutivement sur le site chirurgical rasé. Il faut veiller à maintenir un champ chirurgical stérile. Ensuite, utilisez des ciseaux et des pinces stériles pour faire une incision de 10 millimètres sur le flanc droit à trois millimètres sous l’arc costal.Retirez une section d’un centimètre carré de la peau et utilisez une deuxième paire de ciseaux et de pinces stériles pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau. Déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur une plaque de puits stérile et retirez-la avec une seringue de calibre 31 à appliquer sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager, puis positionnez la fenêtre sur la zone souhaitée et maintenez-la fermement contre le foie pendant environ deux minutes jusqu’à ce que l’adhésif ait séché. Après avoir plié les bords de la fenêtre sous le péritoine, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine, appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.De même, scellez le péritoine en déposant une petite quantité d’adhésif chirurgical avant de pousser la peau vers le bas, puis appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui empêchera la peau de repousser sur la fenêtre. Pour insérer la fenêtre dans le pancréas, placez la souris sur la position de décubitus latéral droit et faites l’incision sur le flanc gauche avant de retirer une section du péritoine comme démontré précédemment. À l’aide de cotons-tiges stériles imbibés de solution saline stérile, tirez doucement la rate pour visualiser le pancréas.Repositionnez le pancréas avec les cotons-tiges humidifiés pour rendre plus de surface visible à travers l’incision. Une fois le pancréas accessible, insérez et scellez la fenêtre d’imagerie sur la zone souhaitée comme expliqué précédemment. Pour accéder à la glande mammaire, placez la souris en position couchée et faites une incision médiale de 10 millimètres sur l’un des mamelons inguinaux à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.Retirez une section de 0,5 centimètre carré de la peau au-dessus de la glande mammaire, puis séparez doucement la glande mammaire de la peau en étalant les ciseaux stériles entre les deux surfaces pour perturber l’adhérence. Utilisez une seringue de calibre 31 pour appliquer une petite quantité d’adhésif chirurgical sur la surface de la glande mammaire autour des bords de la zone à imager. Positionnez et maintenez fermement la fenêtre contre la glande mammaire jusqu’à ce que l’adhésif sèche.Après avoir plié les bords de la fenêtre sous la peau, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui sont maintenant sous la peau et appuyez sur la peau avec une pince pour fixer la peau à la fenêtre. Appliquez la colle autour des bords de la fenêtre pour créer un rebord qui empêchera la peau de repousser sur la fenêtre. Avant de commencer la séance d’imagerie, nettoyez la fenêtre de tout débris résiduel en l’essuyant doucement avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70%.Lorsque vous utilisez une lentille d’immersion dans l’eau, appliquez le gel à ultrasons sur la fenêtre en évitant les bulles. Pour démarrer l’imagerie, localisez et placez la grille au point à travers les oculaires. Déterminez ensuite la profondeur approximative de l’imagerie tissulaire en mettant le bas de la grille à zéro.Les informations aideront à localiser le plan Z correspondant lors de sessions d’imagerie ultérieures. Pour identifier le même emplacement sur plusieurs sessions d’imagerie, utilisez les carrés de la grille comme point de référence. Pendant la séance d’imagerie, notez l’orientation de la grille et l’emplacement de chaque champ de vision imagé dans la grille.La grille peut être utilisée pour revenir à des zones de grille et des champs d’imagerie spécifiques dans le succès des sessions d’imagerie. Après chaque séance d’imagerie, retirez tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et les débris en essuyant doucement la fenêtre avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70%. La fenêtre en silicone permet de capturer l’infiltration dynamique des cellules immunitaires au fil du temps.L’analyse représentative illustre l’infiltration de neutrophiles dans le tissu remodelant de la glande mammaire aux deuxième et quatrième jours. La fenêtre en silicone permet de visualiser les tumeurs à plusieurs moments sur plusieurs semaines après l’insertion de la fenêtre. Les fenêtres coulées avec 200 milligrammes de PDMS sont généralement meilleures pour l’implantation chirurgicale car elles présentaient une ténacité significativement plus grande que les fenêtres coulées avec 150 milligrammes.Il convient de noter que les fenêtres PDMS n’étaient pas aussi rigides que le verre standard, représenté par le module de Young des fenêtres en verre étant significativement plus grand que le PDMS. L’insertion de fenêtres dans différents organes a été bien tolérée car la plupart des souris ont continué à prendre du poids au fil du temps. La chose la plus importante à retenir lors de cette tentative est de sceller complètement la fenêtre à l’aide de colle.Cela empêche l’infection, le dessèchement des tissus et le déplacement de la fenêtre. Après la procédure, les injections orthotopiques peuvent être effectuées à travers la fenêtre en silicone, ce qui permet aux chercheurs d’étudier une grande variété de sujets, tels que la prolifération cellulaire, les interactions cellule-cellule et l’efficacité thérapeutique.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour l&#39;évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Chemoembolization d’accès transradial pour des patients hepatocellulaires de carcinome

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modélisation des métastases cérébrales par injection intracrânienne et imagerie par résonance magnétique

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Découverte de régulateurs métastatiques à l’aide d’un modèle de membrane chorioallantoïque intravitale rapide et quantitative du poussin

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...