Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
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Wir danken Rob Eifert für seine Unterstützung bei der Konstruktion und Optimierung der lasergeschnittenen Edelstahlgitter. Diese Arbeit wurde vom CSHL Cancer Center (P30-CA045508) und Mitteln für M.E. von den National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 und 5P01CA013106-49) unterstützt; CSHL und Northwell Health; die Thompson Family Foundation; Schwimmen Sie durch Amerika; und ein Stipendium der Simons Foundation an CSHL. M.S. wurde vom National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) und dem National Cancer Institute des NIH unter der Preisnummer 1F30CA253993-01 unterstützt. L.M. wird durch ein James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship unterstützt. J.M.A. erhielt ein Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wird von der Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research und der Thompson Family Foundation unterstützt. Cartoons wurden mit Biorender.com erstellt.

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den chirurgischen Richtlinien des Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt und waren vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cold Spring Harbor Laboratory genehmigt worden.
1. Gießen des Silikonfensters 
<ol><li>Bereiten Sie das Silikonpolymer (PDMS) vor, indem Sie das Basiselastomer und den Härter im Verhältnis 10:1 (v/v) mischen.</li>
	<li>Gießen Sie ein Fenster, indem Sie eine kleine Menge PDMS...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Te...

Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren 1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionengeboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h8 abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen 7,9.
Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätzehervorgehoben 10. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten11 auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde12, für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.

Die intravitale Bildgebung durch Bildgebungsfenster kann verwendet werden, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Ereignissen mit Einzelzellauflösung über einen Zeitraum von Stunden bis Wochen zu beobachten, zu verfolgen und zu quantifizieren. Zu den idealen Merkmalen für ein Bildgebungsfenster gehören: a) begrenzte Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Maus und die Physiologie des Gewebes; b) Haltbarkeit; c) Einfachheit des Einfügens; und d) Freie Landmarken für wiederholte Bildgebung derselben Reg...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Dieses Verfahren zum Gießen und Einsetzen von Silikonfenstern senkt die technischen Barrieren für die intravitale Längsbildgebung. Unser Protokoll erzeugt robuste, leicht anpassbare Fenster, die von den Tieren gut vertragen werden. Mit dieser Technik haben wir Krebs und Immunzellen in Leber, Bauchspeicheldrüse und Brustdrüse abgebildet.Mit minimalen Anpassungen konnte es an viele anatomische Standorte und biologische Fragestellungen angepasst werden. Für diejenigen, die diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, üben Sie, kleine Mengen Klebstoff aus der Spritze zu lösen. Das Auftragen von zu viel Klebstoff trübt das Bildgebungsfeld und erschwert die Arbeit mit dem chirurgischen Bereich.Beginnen Sie mit dem Gießen des Silikonfensters, indem Sie eine kleine Menge des frisch hergestellten Silikonpolymers Polydimethylsiloxan von PDMS auf eine saubere, glatte Oberfläche abscheiden und das Verhältnis von Volumen zu Fläche einstellen, um die gewünschte Dicke zu erhalten. Sobald das PDMS auf der gewünschten Gießoberfläche abgeschieden ist, drücken Sie leicht ein Edelstahlgitter in das Silikon, um Orientierungspunkte für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Um die Luftblasen zu entfernen und das Silikonpolymer zu entgasen, legen Sie die beschichtete Oberfläche für 45 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator.Wenn Sie fertig sind, härten Sie das Polymer in einem Ofen bei 75 bis 80 Grad Celsius für 45 Minuten aus. Ritzen Sie das Polymer an den Rändern der Form und verwenden Sie eine Pinzette, um die ausgehärteten Fenster vorsichtig von der Oberfläche zu schälen, die für den Guss verwendet wird. Platzieren Sie die Maus auf der linken seitlichen Dekubitusposition.Bereiten Sie die betäubte Maus für die Operation vor, indem Sie dreimal hintereinander 10% Volumen pro Volumen Povidon-Jodlösung und 70% Volumen Ethanol auf die rasierte Operationsstelle auftragen. Es muss darauf geachtet werden, dass ein steriles Operationsfeld aufrechterhalten wird. Als nächstes verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um einen 10-Millimeter-Schnitt an der rechten Flanke drei Millimeter unterhalb des Rippenbogens zu machen.Entfernen Sie einen um einen Quadratzentimeter großen Hautabschnitt und entfernen Sie mit einer zweiten sterilen Schere und Pinzette einen Abschnitt des Peritoneums, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt. Legen Sie eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf eine sterile Brunnenplatte und ziehen Sie sie mit einer 31-Gauge-Spritze ab, um sie auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs aufzutragen, positionieren Sie dann das Fenster auf dem gewünschten Bereich und halten Sie es etwa zwei Minuten lang fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist. Nachdem Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum gefaltet haben, legen Sie eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs auf die Kanten des Fensters, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden, drücken Sie es mit einer Pinzette auf das Peritoneum, um es am Fenster zu befestigen.Versiegeln Sie das Peritoneum, indem Sie eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs abscheiden, bevor Sie die Haut nach unten drücken, und tragen Sie dann Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst. Um das Fenster in die Bauchspeicheldrüse einzuführen, platzieren Sie die Maus auf der rechten lateralen Dekubitusposition und machen Sie den Schnitt an der linken Flanke, bevor Sie einen Abschnitt des Peritoneums entfernen, wie zuvor gezeigt. Mit sterilen Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung getränkt waren, zog die Milz vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren.Positionieren Sie die Bauchspeicheldrüse mit den angefeuchteten Wattestäbchen neu, um durch den Schnitt mehr Oberfläche sichtbar zu machen. Sobald auf die Bauchspeicheldrüse zugegriffen wird, setzen Sie das Bildfenster auf dem gewünschten Bereich ein und versiegeln Sie es, wie zuvor erläutert. Um auf die Brustdrüse zuzugreifen, platzieren Sie die Maus in Rückenlage und machen Sie einen 10-Millimeter-Schnitt medial zu einer der Leistenbrustwarzen mit steriler Schere und Pinzette.Entfernen Sie einen 0,5 Quadratzentimeter großen Hautabschnitt über der Brustdrüse und trennen Sie dann vorsichtig die Brustdrüse von der Haut, indem Sie die sterile Schere zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die Haftung zu stören. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Spritze, um eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs auf die Oberfläche der Brustdrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs aufzutragen. Positionieren und halten Sie das Fenster fest an der Brustdrüse, bis der Klebstoff trocknet.Nachdem Sie die Kanten des Fensters unter die Haut gefaltet haben, tragen Sie eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Kanten des Fensters auf, die sich jetzt unter der Haut befinden, und drücken Sie sie mit einer Pinzette auf die Haut, um die Haut am Fenster zu befestigen. Tragen Sie den Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu erzeugen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst. Bevor Sie mit der Bildgebungssitzung beginnen, reinigen Sie das Fenster von Restablagerungen, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol getaucht ist.Wenn Sie eine Wassertauchlinse verwenden, tragen Sie das Ultraschallgel auf das Fenster auf und vermeiden Sie Blasen. Um die Bildgebung zu starten, lokalisieren und platzieren Sie das Raster durch das Okular im Fokus. Bestimmen Sie dann die ungefähre Gewebebildgebungstiefe, indem Sie den unteren Rand des Gitters auf Null setzen.Die Informationen helfen bei der Lokalisierung der entsprechenden Z-Ebene in nachfolgenden Bildgebungssitzungen. Um dieselbe Position über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg zu identifizieren, verwenden Sie die Quadrate auf dem Raster als Referenzpunkt. Notieren Sie sich während der Imaging-Sitzung die Rasterausrichtung und die Position jedes Sichtfelds, das im Raster abgebildet ist.Das Raster kann verwendet werden, um beim Erfolg von Bildgebungssitzungen zu bestimmten Rasterbereichen und Bildgebungsfeldern zurückzukehren. Entfernen Sie nach jeder Bildgebungssitzung alle verbleibenden Linsentauchmedien und Ablagerungen, indem Sie das Fenster vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol getaucht ist. Das Silikonfenster ermöglicht es, die dynamische Infiltration von Immunzellen im Laufe der Zeit zu erfassen.Die repräsentative Analyse veranschaulicht die neutrophile Infiltration innerhalb des sich umbauenden Brustdrüsengewebes an den Tagen zwei und vier. Das Silikonfenster ermöglicht es, Tumore zu mehreren Zeitpunkten über Wochen nach dem Fenstereinsetzen zu visualisieren. Die mit 200 Milligramm PDMS gegossenen Fenster eignen sich im Allgemeinen besser für die chirurgische Implantation, da sie eine deutlich höhere Zähigkeit aufweisen als die Fenster mit 150 Milligramm.Bemerkenswert ist, dass die PDMS-Fenster nicht so starr waren wie Standardglas, was durch den Elastizitätsmodul der Glasfenster dargestellt wird, der deutlich größer ist als PDMS. Das Einsetzen des Fensters in verschiedene Organe wurde gut vertragen, da die meisten Mäuse im Laufe der Zeit weiter an Gewicht zunahmen. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, das Fenster vollständig mit Klebstoff abzudichten.Dies verhindert eine Infektion, das Austrocknen des Gewebes und die Verschiebung des Fensters. Nach dem Eingriff können orthotope Injektionen durch das Silikonfenster durchgeführt werden, so dass die Forscher eine Vielzahl von Themen wie Zellproliferation, Zell-Zell-Interaktionen und therapeutische Wirksamkeit untersuchen können.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Forschung

Krebsforschung

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Vergleich von metastasierenden klaren Zell Nierenzellkarzinom Modell in Maus Niere und auf Huhn Chorioallantoic Membran etabliert

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradialer Zugang Chemoembolisierung für hepatozelluläre Karzinom-Patienten

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...