Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

אנו מודים לרוב אייפרט על עזרתו בתכנון ואופטימיזציה של רשתות הנירוסטה שנחתכו בלייזר. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז הסרטן CSHL (P30-CA045508) וכספים עבור M.E. מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01CA2374135 ו- 5P01CA013106-49); CSHL ונורת'וול בריאות; קרן משפחת תומפסון; לשחות ברחבי אמריקה; ומענק מקרן סימונס ל-CSHL. M.S. נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תוכנית הכשרה למדעים רפואיים (T32-GM008444) והמכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס מספר 1F30CA253993-01. L.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן ג'יימס ס. מקדונל. J.M.A. הוא חתן מלגת מכון לחקר הסרטן/מלגת אירווינגטון פוסט-דוקטורט (פרס CRI #3435). D.A.T. נתמך על ידי המעבדה הייעודית של קרן לוסטגרטן לחקר סרטן הלבלב וקרן משפחת תומפסון. קריקטורות נוצרו עם Biorender.com.

כל ההליכים שתוארו בוצעו בהתאם להנחיות הכירורגיות של מעבדת קולד ספרינג הארבור ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת קולד ספרינג הארבור.
1. יציקת חלון הסיליקון 
<ol><li>הכן את פולימר הסיליקון (PDMS) על ידי ערבוב האלסטומר הבסיסי וחומר הריפוי ביחס של ...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפר...

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות 1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור לנדידת תאים ולמגע בין תאים, והציעו פלטפורמה לכמות הדינמיקה המרחבית-טמפורלית בתגובה לפציעה או לזיהום 4,5,6,7. רבים מהתהליכים הללו יכולים להיחקר גם באמצעות כתמים היסטולוגיים, אך רק IVM מאפשר מעקב אחר שינויים דינמיים. למעשה, בעוד שמקטע היסטולוגי מציע תמונת מצב של הרקמה בזמן נתון, הדמיה תוך-תאית יכולה לעקוב אחר אירועים בין-תאיים ותת-תאיים בתוך אותה רקמה לאורך זמן. בפרט, ההתקדמות בתיוג הפלואורסצנטי והתפתחותם של כתבים מולקולריים אפשרו לאירועים מולקולריים להיות מתואמים עם התנהגויות תאיות, כגון התפשטות, מוות, תנועתיות ואינטראקציה עם תאים אחרים או עם המטריצה החוץ-תאית. רוב טכניקות IVM מבוססות על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אשר בשל פיזור אור, מה שהופך את ההדמיה של רקמות עמוקות יותר למאתגרת. הרקמה המעניינת, אם כן, צריכה לעתים קרובות להיחשף בניתוח בהליך פולשני וסופי לעתים קרובות. לכן, בהתאם לאתר האיבר, ניתן לדמות את הרקמה ברציפות במשך תקופה שנעה בין כמה ל -40 שעות8. לחלופין, החדרה כירורגית של חלון הדמיה קבוע מאפשרת הדמיה של אותה רקמה ברצף על פני תקופה של ימים עד שבועות 7,9.
הפיתוח של חלונות הדמיה חדשים הודגש כצורך טכנולוגי לשיפור נוסף של גישות ההדמיה התוך-ויראלית10. חלון ההדמיה התוך-עינית הוא טבעת מתכת המכילה כיסוי זכוכית המחובר לעור עם תפרים11. הפרעה לתנועה חופשית, הצטברות של הפרשה ונזק לכיסוי הזכוכית הם בעיות נפוצות שנראו בשימוש בחלונות כאלה. יתר על כן, החלון האבטיפוסי דורש ייצור מיוחד, וההליך הכירורגי יכול לדרוש הכשרה נרחבת. כדי לטפל בבעיות אלה, פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון, ששימש בעבר בחלונות גולגולת להדמיה ארוכת טווח במוח12, הותאם לשימוש בהדמיית איברי בטן ובלוטת החלב. כאן מוצגת שיטה מפורטת ליצירת חלונות סיליקון מבוססי PDMS, כולל כיצד להטיל את החלון סביב רשת נירוסטה כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת של אותם אזורי רקמה. יתר על כן, מתואר הליך כירורגי פשוט ונטול תפרים להחדרת החלון מעל איברי הבטן או בלוטת החלב. גישה חדשה זו מתגברת על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום ומגבירה את הנגישות של הדמיה תוך-ורידית אורכית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-ורידית דרך חלונות הדמיה כדי לצפות, לעקוב ולכמת מגוון רחב של אירועים תאיים ומולקולריים ברזולוציה של תא יחיד במשך תקופה של שעות עד שבועות. תכונות אידיאליות לחלון הדמיה כוללות: א) השפעה מוגבלת על רווחתו של העכבר ועל הפיזיולוגיה של הרקמה; ב) עמידות; ג) פשטות ההכנסה; ו-ד) צי?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

הליך זה ליציקה והכנסת חלונות סיליקון מוריד את המחסומים הטכניים להדמיה תוך-ורידית אורכית. הפרוטוקול שלנו מייצר חלונות יציבים, הניתנים להתאמה בקלות, אשר נסבלים היטב על ידי בעלי החיים. באמצעות טכניקה זו, דמיינו סרטן ותאי חיסון בכבד, בלבלב ובבלוטת החלב.עם התאמות מינימליות, ניתן היה להתאים אותו למיקומים אנטומיים רבים ולשאלות ביולוגיות. למי שמנסה טכניקה זו בפעם הראשונה, תרגלו שחרור כמויות קטנות של דבק מהמזרק. מריחת יותר מדי דבק תעיב על שדה ההדמיה ותקשה על האזור הכירורגי לעבוד איתו.התחל ליצוק חלון הסיליקון על ידי הפקדת כמות קטנה של פולימר הסיליקון שזה עתה הוכן, polydimethylsiloxane, של PDMS, על משטח חלק ונקי, והתאם את יחס הנפח לאזור כדי לקבל את העובי הרצוי. לאחר הפקדת ה-PDMS על משטח היציקה הרצוי, לחצו קלות על רשת נירוסטה לתוך הסיליקון כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת ונשנית של אותם אזורי רקמה. כדי להסיר את בועות האוויר ולדגה את פולימר הסיליקון, מניחים את המשטח המצופה במייבש ואקום למשך 45 דקות.בסיום, לרפא את הפולימר בתנור ב 75 עד 80 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. נקו את הפולימר בשולי התבנית והשתמשו במלקחיים כדי לקלף בעדינות את החלונות שנרפאו מהמשטח המשמש ליציקה. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי השמאלי.הכן את העכבר המרדים לניתוח על ידי החלת 10% נפח לפי נפח תמיסת יוד povidone ו-70% נפח לפי נפח אתנול שלוש פעמים ברציפות באתר הניתוח המגולח. יש להקפיד על שמירה על שדה כירורגי סטרילי. לאחר מכן, השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לבצע חתך של 10 מילימטרים באגף הימני בשלושה מילימטרים מתחת לקשת הקוסטלית.יש להסיר חלק מרובע אחד של העור ולהשתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר חלק של הצפק מעט קטן יותר מאשר החלק של העור. מפקידים כמות קטנה של דבק כירורגי על צלחת באר סטרילית ומושכים אותה עם מזרק 31 מדים כדי למרוח על פני השטח של הכבד סביב קצוות האזור שיש לדמיין, ואז למקם את החלון על האזור הרצוי, ולהחזיק אותו בחוזקה כנגד הכבד במשך כשתי דקות עד שהדבק התייבש. לאחר קיפול קצוות החלון מתחת למאגר הצפק כמות קטנה של דבק הניתוח בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק, דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לחלון.באופן דומה, אטמו את הצפק על ידי הפקדת כמות קטנה של הדבק הניתוחי לפני דחיפת העור כלפי מטה, ואז מרחו דבק סביב קצות החלון כדי ליצור שפה שתמנע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון. כדי להכניס את החלון ללבלב, הניחו את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי הימני, ובצעו את החתך באגף השמאלי לפני הסרת קטע מהציפור כפי שהודגם קודם לכן. באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים, משכו בעדינות את הטחול כדי לדמיין את הלבלב.מקם מחדש את הלבלב עם מטושים מכותנה לחה כדי להפוך שטח פנים רב יותר גלוי דרך החתך. לאחר הגישה ללבלב, הכנס ואטם את חלון ההדמיה על האזור הרצוי כפי שהוסבר קודם לכן. כדי לגשת לבלוטת החלב, מניחים את העכבר במצב שכיבה, ועושים חתך 10 מילימטר מדיאלי לאחת הפטמות המפשעתיות באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.יש להסיר קטע של 0.5 סנטימטרים רבועים של העור מעל בלוטת החלב, ולאחר מכן להפריד בעדינות את בלוטת החלב מהעור על ידי פיזור המספריים הסטריליים בין שני המשטחים כדי לשבש את ההדבקה. השתמש במזרק מד 31 כדי להחיל כמות קטנה של דבק הניתוח על פני השטח של בלוטת החלב סביב קצוות האזור כדי להצטלם. מקם והחזק את החלון בחוזקה כנגד בלוטת החלב עד שהדבק מתייבש.לאחר קיפול קצוות החלון מתחת לעור, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לעור, ודחפו למטה על העור עם מלקחיים כדי להדק את העור לחלון. מרחו את הדבק סביב קצות החלון כדי ליצור שפה שתמנע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון. לפני תחילת סשן ההדמיה, נקו את החלון מכל שארית פסולת על ידי ניגוב עדין שלו עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול.בעת שימוש בעדשת טבילה במים, יש למרוח את ג'ל האולטרסאונד על החלון ולהימנע מבועות. כדי להתחיל את ההדמיה, אתרו והניחו את הרשת במוקד דרך העיניים. לאחר מכן קבע את עומק הדמיית הרקמה המשוער על-ידי הגדרת תחתית הרשת לאפס.המידע יסייע באיתור מישור ה-Z המתאים במפגשי ההדמיה הבאים. כדי לזהות את אותו מיקום במשך מספר הפעלות הדמיה, השתמש בריבועים שעל הרשת כנקודת ייחוס. במהלך הפעלת ההדמיה, שים לב לכיוון הרשת ולמיקום של כל שדה ראייה המצולם בתוך הרשת.ניתן להשתמש ברשת כדי לנווט בחזרה לאזורי רשת ספציפיים ולשדות הדמיה בהצלחה של הפעלות הדמיה. לאחר כל סשן הדמיה יש להסיר כל מדיום טבילה של עדשה שיורית ופסולת על ידי ניגוב עדין של החלון עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול. חלון הסיליקון מאפשר ללכוד את חדירת תאי החיסון הדינמיים לאורך זמן.הניתוח הייצוגי ממחיש את חדירת הנויטרופילים לתוך רקמת בלוטת החלב המשפצת בימים השני והרביעי. חלון הסיליקון מאפשר לדמיין גידולים בנקודות זמן מרובות במשך שבועות לאחר החדרת החלון. החלונות יצוקים עם 200 מיליגרם של PDMS הם בדרך כלל טובים יותר עבור השתלה כירורגית כפי שהם הפגינו קשיחות גדולה יותר באופן משמעותי מאשר החלונות יצוקים עם 150 מיליגרם.יש לציין כי חלונות PDMS לא היו קשיחים כמו זכוכית סטנדרטית, המיוצגת על ידי מודולוס יאנג של חלונות הזכוכית שהיה גדול משמעותית מ- PDMS. החדרת החלון באיברים שונים הייתה נסבלת היטב מכיוון שרוב העכברים המשיכו לעלות במשקל לאורך זמן. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא לאטום את החלון באופן מלא באמצעות דבק.זה מונע זיהום, הרקמה מלהתייבש, ואת התזוזה של החלון. בעקבות ההליך, ניתן לבצע זריקות אורתוטופיות דרך חלון הסיליקון, מה שמאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של נושאים, כגון התפשטות תאים, אינטראקציות בין תאים ויעילות טיפולית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

הערכת מיקרוסביבה הגידול של גרורה בתיווך החדירות כלי דם הקשורים להפצת תאים סרטניים באמצעות הדמיה Intravital וניתוח רקמות קבוע

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

גישה טרנסרדיאלית Chemoembolization לחולי קרצינומה hepatocellular

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

מידול גרורות מוח באמצעות הזרקה תוך גולגולתית והדמיית תהודה מגנטית

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...