Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
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Ringraziamo Rob Eifert per la sua assistenza nella progettazione e ottimizzazione delle griglie in acciaio inossidabile tagliate al laser. Questo lavoro è stato sostenuto dal CSHL Cancer Center (P30-CA045508) e dai fondi per M.E. del National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; la Thompson Family Foundation; Nuota attraverso l'America; e una sovvenzione della Simons Foundation a CSHL. M.S. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio 1F30CA253993-01. L.M. è supportato da una James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. ha ricevuto una Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. è sostenuto dal Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research e dalla Thompson Family Foundation. I cartoni animati sono stati creati con Biorender.com.

Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida chirurgiche del laboratorio di Cold Spring Harbor ed erano state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il laboratorio di Cold Spring Harbor.
1. Fusione della finestra in silicone 
<ol><li>Preparare il polimero siliconico (PDMS) mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 (v/v).</li>
	<li>Getta una finestra depositando un...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l'inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l'accessibilità di questa ...

La microscopia intravitale (IVM), l'imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci 1,2,3. Inoltre, l'IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che governano le risposte immunitarie fornendo approfondimenti complementari agli approcci di profilazione ex vivo (ad esempio, citometria a flusso). Ad esempio, esperimenti di imaging intravitale hanno rivelato dettagli sulle funzioni immunitarie in relazione alla migrazione cellulare e al contatto cellula-cellula e hanno offerto una piattaforma per quantificare le dinamiche spazio-temporali in risposta a lesioni o infezioni 4,5,6,7. Molti di questi processi possono anche essere studiati attraverso la colorazione istologica, ma solo IVM consente il tracciamento dei cambiamenti dinamici. Infatti, mentre una sezione istologica offre un'istantanea del tessuto in un dato momento, l'imaging intravitale può tracciare eventi intercellulari e subcellulari all'interno dello stesso tessuto nel tempo. In particolare, i progressi nell'etichettatura della fluorescenza e lo sviluppo di reporter molecolari hanno permesso di correlare eventi molecolari con comportamenti cellulari, come la proliferazione, la morte, la motilità e l'interazione con altre cellule o la matrice extracellulare. La maggior parte delle tecniche IVM si basa sulla microscopia a fluorescenza, che a causa della diffusione della luce, rende difficile l'imaging di tessuti più profondi. Il tessuto di interesse, quindi, ha spesso bisogno di essere esposto chirurgicamente con una procedura spesso invasiva e terminale. Pertanto, a seconda del sito dell'organo, il tessuto può essere ripreso continuamente per un periodo che varia da pochi a 40 h8. In alternativa, l'inserimento chirurgico di una finestra di imaging permanente consente l'imaging dello stesso tessuto in sequenza per un periodo da giorni a settimane 7,9.
Lo sviluppo di nuove finestre di imaging è stato evidenziato come una necessità tecnologica per migliorare ulteriormente gli approcci di imaging intravitale10. La finestra di imaging intravitale prototipica è un anello metallico contenente una copertura di vetro fissata alla pelle con punti di sutura11. L'interferenza con la libera circolazione, l'accumulo di essudato e il danneggiamento del coperchio di vetro sono problemi comuni riscontrati con l'uso di tali finestre. Inoltre, la finestra prototipica richiede una produzione specializzata e la procedura chirurgica può richiedere una formazione approfondita. Per affrontare questi problemi, il polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico, che è stato precedentemente utilizzato nelle finestre craniche per l'imaging a lungo termine nel cervello12, è stato adattato per l'uso nell'imaging degli organi addominali e delle ghiandole mammarie. Qui, viene presentato un metodo dettagliato per generare finestre in silicone basate su PDMS, incluso come gettare la finestra attorno a una griglia in acciaio inossidabile per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Inoltre, viene descritta una procedura chirurgica semplice e priva di punti per l'inserimento della finestra sugli organi addominali o sulla ghiandola mammaria. Questo nuovo approccio supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate e aumenta l'accessibilità dell'imaging intravitale longitudinale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L'IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l'osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l'eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l'imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l'inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L'imaging longitudinale è l'imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all'interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l'involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un'infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.

L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging può essere utilizzato per osservare, tracciare e quantificare una vasta gamma di eventi cellulari e molecolari a risoluzione di una singola cellula per un periodo di ore o settimane. Le caratteristiche ideali per una finestra di imaging includono: a) impatto limitato sul benessere del topo e sulla fisiologia del tessuto; b) durata; c) semplicità di inserimento; e d) chiari punti di riferimento per l'imaging ripetuto della stessa regione. Il risultato è una finestra ...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Questa procedura per la fusione e l'inserimento di finestre in silicone riduce le barriere tecniche all'imaging intravitale longitudinale. Il nostro protocollo produce finestre robuste, facilmente adattabili e ben tollerate dagli animali. Usando questa tecnica, abbiamo immaginato il cancro e le cellule immunitarie nel fegato, nel pancreas e nella ghiandola mammaria.Con aggiustamenti minimi, potrebbe essere adattato a molte posizioni anatomiche e questioni biologiche. Per coloro che provano questa tecnica per la prima volta, esercitati a rilasciare piccole quantità di colla dalla siringa. L'applicazione di troppa colla offuscherà il campo di imaging e renderà difficile lavorare l'area chirurgica.Inizia a fondere la finestra in silicone depositando una piccola quantità del polimero siliconico appena preparato, il polidimetilsilossano, di PDMS, su una superficie liscia e pulita e regola il rapporto volume/ area per ottenere lo spessore desiderato. Una volta depositato il PDMS sulla superficie di fusione desiderata, premere leggermente una griglia di acciaio inossidabile nel silicone per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Per rimuovere le bolle d'aria e degassare il polimero siliconico, posizionare la superficie rivestita in un essiccatore sottovuoto per 45 minuti.Al termine, polimerizzare il polimero in un forno a 75-80 gradi Celsius per 45 minuti. Segnare il polimero ai bordi dello stampo e utilizzare una pinza per staccare delicatamente le finestre indurite dalla superficie utilizzata per la fusione. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale sinistro.Preparare il topo anestetizzato per la chirurgia applicando il 10% volume per volume di soluzione di iodio povidone e il 70% volume per volume di etanolo tre volte consecutivamente sul sito chirurgico rasato. Bisogna fare attenzione a mantenere un campo chirurgico sterile. Quindi, utilizzare forbici e pinze sterili per eseguire un'incisione di 10 millimetri sul fianco destro a tre millimetri sotto l'arco costale.Rimuovere una sezione di un centimetro quadrato della pelle e utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione della pelle. Depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico su una piastra di pozzo sterile e prelevarla con una siringa calibro 31 da applicare sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da fotografare, quindi posizionare la finestra sull'area desiderata e tenerla saldamente contro il fegato per circa due minuti fino a quando l'adesivo non si è asciugato. Dopo aver piegato i bordi della finestra sotto il peritoneo depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo, spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.Allo stesso modo, sigillare il peritoneo depositando una piccola quantità di adesivo chirurgico prima di spingere verso il basso la pelle, quindi applicare la colla attorno ai bordi della finestra per creare un bordo che impedisca alla pelle di ricrescere sopra la finestra. Per inserire la finestra nel pancreas, posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale destro e fare l'incisione sul fianco sinistro prima di rimuovere una sezione del peritoneo come dimostrato in precedenza. Usando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile, ha tirato delicatamente la milza per visualizzare il pancreas.Riposizionare il pancreas con i tamponi di cotone inumiditi per rendere più visibile la superficie attraverso l'incisione. Una volta effettuato l'accesso al pancreas, inserire e sigillare la finestra di imaging sull'area desiderata come spiegato in precedenza. Per accedere alla ghiandola mammaria, posizionare il topo in posizione supina e fare un'incisione mediale di 10 millimetri a uno dei capezzoli inguinali usando forbici e pinze sterili.Rimuovere una sezione di 0,5 centimetri quadrati della pelle sopra la ghiandola mammaria, quindi separare delicatamente la ghiandola mammaria dalla pelle diffondendo le forbici sterili tra le due superfici per interrompere l'aderenza. Utilizzare una siringa calibro 31 per applicare una piccola quantità di adesivo chirurgico sulla superficie della ghiandola mammaria intorno ai bordi dell'area da visualizzare. Posizionare e tenere saldamente la finestra contro la ghiandola mammaria fino a quando l'adesivo si asciuga.Dopo aver piegato i bordi della finestra sotto la pelle, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora sono sotto la pelle e spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissare la pelle alla finestra. Applicare la colla attorno ai bordi della finestra per creare un bordo che impedisca alla pelle di ricrescere sopra la finestra. Prima di iniziare la sessione di imaging, pulire la finestra da eventuali detriti residui pulendola delicatamente con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.Quando si utilizza una lente ad immersione in acqua, applicare il gel ad ultrasuoni alla finestra evitando bolle. Per avviare l'imaging, individuare e posizionare la griglia a fuoco attraverso gli oculari. Quindi determinare la profondità approssimativa dell'imaging tissutale impostando la parte inferiore della griglia su zero.Le informazioni aiuteranno a localizzare il piano Z corrispondente nelle successive sessioni di imaging. Per identificare la stessa posizione in più sessioni di imaging, utilizzare i quadrati sulla griglia come punto di riferimento. Durante la sessione di imaging, annotare l'orientamento della griglia e la posizione di ciascun campo visivo ripreso all'interno della griglia.La griglia può essere utilizzata per tornare a specifiche aree della griglia e campi di imaging nel successo delle sessioni di imaging. Dopo ogni sessione di imaging rimuovere eventuali residui di immersione della lente e detriti pulendo delicatamente la finestra con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%. La finestra in silicone permette di catturare l'infiltrazione dinamica delle cellule immunitarie nel tempo.L'analisi rappresentativa illustra l'infiltrazione dei neutrofili all'interno del tessuto mammario rimodellante ai giorni due e quattro. La finestra in silicone consente di visualizzare i tumori in più punti temporali per settimane dopo l'inserimento della finestra. Le finestre fuse con 200 milligrammi di PDMS sono generalmente migliori per l'impianto chirurgico in quanto hanno mostrato una tenacità significativamente maggiore rispetto alle finestre fuse con 150 milligrammi.Da notare, le finestre PDMS non erano rigide come il vetro standard, rappresentato dal modulo di Young delle finestre di vetro significativamente maggiore del PDMS. L'inserimento della finestra in diversi organi è stato ben tollerato poiché la maggior parte dei topi ha continuato ad aumentare di peso nel tempo. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è sigillare completamente la finestra usando la colla.Ciò impedisce l'infezione, l'essiccazione del tessuto e lo spostamento della finestra. Seguendo la procedura, le iniezioni ortotopiche possono essere eseguite attraverso la finestra di silicone, consentendo ai ricercatori di studiare un'ampia varietà di argomenti, come la proliferazione cellulare, le interazioni cellula-cellula e l'efficacia terapeutica.

Research

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Cancer Research

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