Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
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レーザーカットされたステンレス鋼グリッドの設計と最適化におけるロブ・アイファートの支援に感謝します。この研究は、CSHLがんセンター(P30-CA045508)および国立衛生研究所(NIH)からのM.E.のための資金(1R01CA2374135および5P01CA013106-49)によって支援された。CSHLとノースウェルヘルス;トンプソン家族財団;アメリカ全土を泳ぐ。サイモンズ財団からCSHLへの助成金。M.S.は、一般医科学研究所医学者養成プログラム研修賞(T32-GM008444)およびNIH国立がん研究所(受賞番号1F30CA253993-01)の支援を受けました。L.M.はジェームズ・S・マクドネル財団のポスドク・フェローシップの支援を受けています。J.M.A.は、がん研究所/アービントン・ポスドク・フェローシップ(CRI賞#3435)の受賞者です。D.A.T.は、Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer ResearchとThompson Family Foundationの支援を受けています。漫画は Biorender.com で作成されました。

記載されているすべての手順は、コールドスプリングハーバー研究所外科ガイドラインに従って行われ、コールドスプリングハーバー研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されていました。
1.シリコンウィンドウを鋳造する 
<ol><li>シリコーンポリマー(PDMS)を調製するには、ベースエラストマーと硬化剤を10:1(v/v)の比率で混合します。</li>
	<li...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

生体内イメージングウィンドウは、生理学的および病理学的プロセスを細胞分解能で直接視覚化するための重要なツールです。マウスに柔軟なシリコーンイメージングウィンドウをキャスティングおよび挿入するために説明されている新しい手順は、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題(滲出液、破損、および通常の可動性との干渉)のいくつかを克服し、マウス?...

麻酔をかけられた動物の組織のイメージングである生体内顕微鏡(IVM)は、無傷の組織における細胞分解能での生理学的および病理学的事象のダイナミクスへの洞察を提供する。この技術の応用は多岐にわたりますが、IVMはがん生物学の分野で、がん細胞が組織に侵入して転移し、周囲の微小環境と相互作用し、薬物にどのように反応するかを解明するのに役立つ1、2、3。さらに、IVMは、エクスビボプロファイリングアプローチ(例えば、フローサイトメトリー)を補完する洞察を提供することにより、免疫応答を支配する複雑なメカニズムの理解を促進するための鍵となっています。例えば、生体内イメージング実験は、細胞遊走および細胞間接触に関連する免疫機能の詳細を明らかにし、傷害または感染に応答して時空間ダイナミクスを定量するためのプラットフォームを提供している4,5,6,7。これらのプロセスの多くは、組織学的染色によっても研究することができるが、動的変化の追跡を可能にするのはIVMのみである。実際、組織学的切片は所与の時間における組織のスナップショットを提供するが、インバイタルイメージングは、同じ組織内の細胞間および細胞内事象を経時的に追跡することができる。特に、蛍光標識の進歩と分子レポーターの発達により、分子事象は、増殖、死、運動性、および他の細胞または細胞外マトリックスとの相互作用などの細胞挙動と相関することが可能になった。ほとんどのIVM技術は蛍光顕微鏡法に基づいており、光散乱のためにより深い組織のイメージングを困難にします。したがって、関心のある組織は、しばしば侵襲的および終末的処置で外科的に曝露される必要がある。したがって、器官部位に応じて、組織を、数時間から40時間8まで変化する期間にわたって連続的に画像化することができる。あるいは、永久的な画像化窓の外科的挿入は、7、9週までの数日にわたって同じ組織の画像化を順次可能にする。
新しいイメージングウィンドウの開発は、バイタル内イメージングアプローチをさらに改善するための技術的必要性として強調されています10。プロトタイプのインタビタル画像化ウィンドウは、縫合糸11で皮膚に固定されたガラスカバースリップを含む金属リングである。自由な動きへの干渉、滲出液の蓄積、およびガラスカバースリップの損傷は、そのような窓の使用で見られる一般的な問題である。さらに、プロトタイプウィンドウは特殊な生産を必要とし、外科的処置は広範なトレーニングを必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、シリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)は、以前は脳12における長期画像化のための頭蓋窓において使用されていたが、腹部器官および乳腺画像化における使用のために適合された。ここでは、PDMSベースのシリコーン窓を生成するための詳細な方法が提示され、同じ組織領域の反復画像化のためのランドマークを提供するためにステンレス鋼グリッドの周りに窓を鋳造する方法を含む。さらに、腹部器官または乳腺の上に窓を挿入するための簡単でステッチフリーの外科的処置が記載されている。この新しいアプローチは、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題のいくつかを克服し、縦方向のインタビタルイメージングのアクセシビリティを向上させます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

生体内顕微鏡(IVM)は、単一細胞分解能での細胞移動、分裂、および死の可視化を可能にします。外科的に挿入されたイメージングウィンドウを通るIVMは、数日から数週間にわたって同じ組織の縦断的観察を可能にするため、特に強力である。典型的なイメージングウィンドウは、マウスの皮膚に縫合された生体適合性の金属フレーム内のガラスカバースリップで構成されています。これらの窓は、マウスの自由な動きを妨げ、強い炎症反応を誘発し、ガラスの破損または破れた縫合糸のために失敗し、そのいずれもが安楽死を必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、長期腹部器官および乳腺イメージング用の窓は、以前は頭蓋イメージング窓に使用されていた光学的に透明なシリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄膜から開発された。これらの窓は組織に直接接着することができ、挿入に必要な時間を短縮する。PDMSは柔軟性があり、マウスの耐久性に寄与し、時間の経過とともに最大35日間試験されています。縦方向イメージングは、別々のセッション中に同じ組織領域をイメージングすることです。ステンレス製のグリッドが窓に埋め込まれ、同じ領域をローカライズし、数日離れた同じ場所での動的プロセス(乳腺の退縮など)の視覚化を可能にしました。このシリコーンウィンドウはまた、時間の経過とともに微小転移に発達する単一の播種性癌細胞のモニタリングを可能にした。この研究で使用されたシリコーン窓は、金属フレームのガラス窓よりも挿入が簡単で、画像化された組織の炎症を制限します。さらに、埋め込みグリッドにより、繰り返しイメージングセッションで同じ組織領域を簡単に追跡できます。

イメージングウィンドウによるイントラバイタルイメージングは、数時間から数週間にわたって単一細胞分解能で幅広い細胞および分子イベントを観察、追跡、定量するために使用できます。イメージングウィンドウのための理想的な特徴には、a)マウスの幸福および組織の生理機能に対する限られた影響が含まれる。b)耐久性;c)挿入の単純さ;d)同じ領域の繰り返し画像化のための明確なラン...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

ここでは、関心のある組織/器官および皮膚に直接接着することができる光学的に透明なシリコーン窓を使用して、長期の生体内イメージングのためのアプローチを提示する。これらの窓は、現在現場で使用されている他の窓よりも安価で汎用性が高く、外科的挿入は動物に限られた炎症および苦痛を引き起こす。

透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

シリコーン窓を鋳造および挿入するためのこの手順は、縦方向の生体内イメージングに対する技術的障壁を低下させる。私たちのプロトコルは、動物によって十分に許容される頑丈で簡単に適応可能な窓を作り出します。この技術を用いて、肝臓、膵臓、乳腺のがんや免疫細胞をイメージングしました。最小限の調整で、多くの解剖学的位置や生物学的な質問に適応させることができます。このテクニックを初めて試す人のために、シリンジから少量の接着剤を放出する練習をしてください。接着剤を塗りすぎると、イメージングフィールドが曇り、手術領域が作業しにくくなります。PDMSの新しく調製したシリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサンを少量、きれいな滑らかな表面に堆積させることによってシリコーン窓の鋳造を開始し、体積対面積比を調整して所望の厚さを得る。PDMSが所望の鋳造面に堆積したら、ステンレス鋼グリッドをシリコーンに軽く押し込んで、同じ組織領域を繰り返しイメージングするためのランドマークを提供する。気泡を除去し、シリコーンポリマーを脱気するために、コーティングされた表面を真空デシケーターに45分間置く。完了したら、75〜80°Cのオーブンで45分間ポリマーを硬化させます。金型の端にポリマーをスコアリングし、鉗子を使用して、鋳造に使用した表面から硬化した窓を静かに剥がします。マウスを左側方褥瘡の位置に置きます。剃毛した手術部位にポビドンヨウ素溶液10体積%およびエタノール70体積%を3回連続して塗布することによって、麻酔をかけたマウスを手術用に準備する。滅菌された手術野を維持するために注意を払わなければならない。次に、滅菌ハサミと鉗子を使用して、肋骨アーチの3ミリメートル下の右脇腹に10ミリメートルの切開を行います。皮膚の1平方センチメートルのセクションを取り除き、2対目の滅菌ハサミおよび鉗子を使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを除去する。滅菌ウェルプレートに少量の外科用接着剤を堆積させ、31ゲージシリンジでそれを引き出して、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に塗布し、次いで窓を所望の領域に置き、接着剤が乾燥するまで約2分間肝臓に対してしっかりと保持する。腹膜の下の窓の縁を折り畳んだ後、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させ、鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定する。同様に、皮膚を押し下げる前に少量の外科用接着剤を付着させて腹膜を密封し、次いで窓の端の周りに接着剤を塗布して、皮膚が窓の上に再び成長するのを防ぐ縁を作る。膵臓に窓を挿入するには、マウスを右側方褥瘡の位置に置き、左脇腹に切開をしてから、前述のように腹膜の一部を除去します。滅菌生理食塩水で浸した滅菌綿棒を用いて、脾臓を優しく引っ張り、膵臓を視覚化した。湿らせた綿棒で膵臓の位置を変えて、切開部を通してより多くの表面積が見えるようにします。膵臓にアクセスしたら、前に説明したように、イメージングウィンドウを目的の領域に挿入して密封します。乳腺にアクセスするには、マウスを仰臥位に置き、滅菌はさみと鉗子を使用して鼠径乳首の1つに10ミリメートルの切開内側を作ります。乳腺の上の皮膚の0.5平方センチメートルの部分を取り除き、その後、付着を破壊するために2つの表面の間に滅菌はさみを広げることによって乳腺を皮膚から静かに分離する。31ゲージシリンジを使用して、画像化する領域の縁の周りの乳腺の表面に少量の外科用接着剤を塗布する。接着剤が乾くまで、窓を乳腺にしっかりと押し付けます。窓の縁を皮膚の下に折り畳んだ後、皮膚の下にある窓の端に少量の手術用接着剤を付着させ、鉗子で皮膚を押し下げて皮膚を窓に固定する。窓の端の周りに接着剤を塗布して、皮膚が窓の上に再び成長するのを防ぐ縁を作ります。イメージングセッションを開始する前に、70%エタノールに浸した綿棒で窓を優しく拭いて、残留破片から窓をきれいにしてください。水浸漬レンズを利用する場合は、超音波ゲルを窓に塗布し、気泡を避けてください。イメージングを開始するには、眼を通してグリッドの位置を見つけて焦点を合わせます。次に、グリッドの下部をゼロに設定して、おおよその組織イメージング深度を決定します。この情報は、後続のイメージングセッションで対応するZ平面を見つけるのに役立ちます。複数のイメージングセッションで同じ位置を特定するには、グリッド上の正方形を参照点として使用します。イメージングセッション中に、グリッドの向きと、グリッド内でイメージングされた各視野の位置を書き留めます。グリッドを使用して、イメージングセッションの成功時に特定のグリッド領域およびイメージングフィールドに戻ることができます。各撮影セッションに続いて、70%エタノールに浸した綿棒で窓を優しく拭いて、残留レンズ浸漬媒体および破片を除去する。シリコーンウィンドウは、時間の経過とともに動的な免疫細胞浸潤を捕捉することを可能にする。代表的な分析は、2日目および4日目におけるリモデリング乳腺組織内の好中球浸潤を示す。シリコーンウィンドウは、ウィンドウ挿入後数週間にわたって複数の時点で腫瘍を視覚化することを可能にする。200ミリグラムのPDMSで鋳造された窓は、150ミリグラムの窓鋳造よりも有意に大きな靭性を示したため、一般に外科的移植に優れています。注目すべきは、PDMS窓は標準的なガラスほど剛性がなく、ガラス窓のヤング率がPDMSよりも有意に高いことに表された。異なる器官への窓の挿入は、ほとんどのマウスが時間の経過とともに体重を増やし続けたため、忍容性が良好であった。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、接着剤を使用して窓を完全に密閉することです。これにより、感染、組織の乾燥、および窓の変位を防ぐことができます。この手順に続いて、同所性注射をシリコーンウィンドウを介して行うことができ、研究者は細胞増殖、細胞間相互作用、治療効果など、さまざまなトピックを研究することができます。

Research

JoVE Journal

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