Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

레이저 컷 스테인레스 스틸 그리드를 설계하고 최적화하는 데 도움을 주신 Rob Eifert에게 감사드립니다. 이 연구는 CSHL 암 센터 (P30-CA045508)와 국립 보건원 (NIH)의 M.E. 기금 (1R01CA2374135 및 5P01CA013106-49)에 의해 지원되었습니다. CSHL 및 노스웰 헬스; 톰슨 가족 재단; 미국 전역에서 수영; Simons Foundation에서 CSHL에 대한 보조금. M.S.는 국립 일반 의료 과학 연구소 의료 과학자 교육 프로그램 교육 상 (T32-GM008444)과 NIH의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 수상 번호 1F30CA253993-01의 지원을 받았습니다. L.M.은 James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. J.M.A.는 암 연구소 / 어빙턴 박사 후 펠로우십 (CRI 상 # 3435)을 수상했습니다. D.A.T.는 Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research 및 Thompson Family Foundation의 지원을 받습니다. 만화는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

설명 된 모든 절차는 콜드 스프링 하버 실험실 외과 지침에 따라 수행되었으며 콜드 스프링 하버 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 실리콘 창 주조 
<ol><li>베이스 엘라스토머와 경화제를 10:1 (v/v) 비율로 혼합하여 실리콘 폴리머(PDMS)를 준비합니다.</li>
	<li>멸균되고 매끄러운 표면에 소량의 PDMS를 증착하여 창을 캐스팅하고 부피 대 ...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravital 이미징 창은 시간이 지남에 따라 펼쳐지는 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 과정을 직접 시각화하는 데 중요한 도구입니다. 마우스에 유연한 실리콘 이미징 창을 주조 및 삽입하기 위해 설명 된 새로운 절차는 현재 사용되는 이미징 창 (삼출, 파손 및 정상적인 이동성과의 간섭)의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 마우스에 대한 추가 안전성을 제공하며이 기술의 접근성을 ...

마취 된 동물의 조직 이미징 인 Intravital Microscopy (IVM)는 손상되지 않은 조직에서 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 사건의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 적용은 매우 다양하지만 IVM은 암 생물학 분야에서 암세포가 조직을 침범하고 전이하는 방법을 밝히고 주변 미세 환경과 상호 작용하며 약물 1,2,3에 반응하는 데 도움이되었습니다. 또한, IVM은 생체외 프로파일링 접근법(예를 들어, 유세포 분석기)에 상보적인 통찰을 제공함으로써 면역 반응을 지배하는 복잡한 메카니즘의 이해를 증진시키는 열쇠가 되었다. 예를 들어, 생체 내 영상 실험은 세포 이동 및 세포 - 세포 접촉과 관련된 면역 기능에 대한 세부 사항을 밝혀 냈으며 부상이나 감염에 대한 반응으로 시공간 역학을 정량화하는 플랫폼을 제공했습니다 4,5,6,7. 이러한 과정의 대부분은 조직 학적 염색을 통해 연구 될 수도 있지만 IVM 만이 동적 변화를 추적 할 수 있습니다. 사실, 조직학적 섹션이 주어진 시간에 조직의 스냅샷을 제공하는 반면, 생체내 영상은 시간이 지남에 따라 동일한 조직 내의 세포간 및 세포내 사건을 추적할 수 있다. 특히, 형광 표지의 진행과 분자 리포터의 개발은 분자 사건이 증식, 사망, 운동성 및 다른 세포 또는 세포외 매트릭스와의 상호 작용과 같은 세포 거동과 상관되도록 허용했다. 대부분의 IVM 기술은 형광 현미경을 기반으로하며, 이는 광 산란으로 인해 더 깊은 조직을 이미징하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 관심있는 조직은 종종 종종 침습적 및 말단 절차로 외과 적으로 노출되어야합니다. 따라서, 기관 부위에 따라, 조직은 몇 내지 40h8에서 변화하는 기간 동안 연속적으로 영상화될 수 있다. 대안적으로, 영구적인 이미징 윈도우의 외과적 삽입은 7,9주까지의 기간에 걸쳐 순차적으로 동일한 조직의 영상화를 허용한다.
새로운 이미징 윈도우의 개발은 인트라바이탈 이미징 접근법(10)을 더욱 개선하기 위한 기술적 필요성으로서 강조되고 있다. 원형 생체내 영상화 창은 봉합사(11)로 피부에 고정된 유리 커버슬립을 포함하는 금속 링이다. 자유로운 움직임에 대한 간섭, 삼출물의 축적 및 유리 커버 슬립의 손상은 이러한 창문을 사용할 때 볼 수있는 일반적인 문제입니다. 또한, 프로토 타입 창은 전문적인 생산이 필요하며 외과 수술은 광범위한 교육이 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 이전에 뇌(12)의 장기 이미징을 위해 두개골 창문에 사용되어온 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산(PDMS)이 복부 장기 및 유선 영상화에 사용하도록 조정되었다. 여기에서, 동일한 조직 영역의 반복적인 이미징을 위한 랜드마크를 제공하기 위해 스테인리스강 그리드 주위에 윈도우를 캐스팅하는 방법을 포함하는 PDMS 기반 실리콘 윈도우를 생성하기 위한 상세한 방법이 제시된다. 또한, 복부 장기 또는 유선에 창을 삽입하기위한 간단하고 스티치가없는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 현재 사용되는 이미징 창의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 종방향 생체 내 영상의 접근성을 높입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

생체 내 현미경 검사 (IVM)는 단일 세포 분해능에서 세포 이동, 분열 및 사망의 시각화를 가능하게합니다. 외과적으로 삽입된 이미징 윈도우를 통한 IVM은 수일 내지 수주에 걸쳐 동일한 조직의 종방향 관찰을 허용하기 때문에 특히 강력하다. 일반적인 이미징 창은 마우스의 피부에 봉합된 생체적합성 금속 프레임의 유리 커버슬립을 포함한다. 이 창문은 생쥐의 자유로운 움직임을 방해하고 강한 염증 반응을 이끌어 낼 수 있으며 깨진 유리 또는 찢어진 봉합사로 인해 실패 할 수 있으며 그 중 어느 것도 안락사가 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 장기 복부 장기 및 유선 이미징을위한 창문은 이전에 두개골 이미징 창에 사용 된 광학적으로 투명한 실리콘 폴리머 인 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 박막으로 개발되었습니다. 이 창문은 조직에 직접 접착 할 수있어 삽입에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PDMS는 유연하여 시간이 지남에 따라 마우스의 내구성에 기여하며 최대 35 일이 테스트되었습니다. 종방향 영상화는 개별 세션 동안 동일한 조직 영역의 영상화이다. 스테인리스 스틸 그리드가 창문 내에 내장되어 동일한 지역을 현지화하여 며칠 간격으로 동일한 위치에서 동적 프로세스 (예 : 유선의 개입)를 시각화 할 수있었습니다. 이 실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 미세 전이로 발전하는 단일 전파 암 세포를 모니터링 할 수있었습니다. 이 연구에 사용 된 실리콘 창은 금속 프레임 유리 창보다 삽입하기가 간단하며 이미지 된 조직의 제한된 염증을 일으 킵니다. 또한, 임베디드 그리드는 반복 이미징 세션에서 동일한 조직 영역의 간단한 추적을 허용합니다.

이미징 창을 통한 생체 내 이미징은 몇 시간에서 몇 주에 걸쳐 단일 세포 분해능에서 광범위한 세포 및 분자 사건을 관찰, 추적 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 윈도우에 이상적인 특징은 다음을 포함한다: a) 마우스의 웰빙 및 조직의 생리학에 대한 제한된 영향; b) 내구성; c) 삽입의 단순성; d) 동일한 영역의 반복 이미징을위한 명확한 랜드 마크. 그 결과 다용도의 불활성 실리콘 윈?...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

실리콘 창문을 주조 및 삽입하는이 절차는 종방향 생체 내 이미징에 대한 기술적 장벽을 낮 춥니 다. 우리의 프로토콜은 동물에 의해 잘 견딜 수있는 튼튼하고 쉽게 적응할 수있는 창문을 생산합니다. 이 기술을 사용하여 간, 췌장 및 유선의 암과 면역 세포를 이미지화했습니다.최소한의 조정으로 많은 해부학 적 위치와 생물학적 질문에 적응할 수 있습니다. 처음으로이 기술을 시도하는 사람들은 주사기에서 소량의 접착제를 방출하는 연습을하십시오. 접착제를 너무 많이 바르면 이미징 필드가 흐려지고 수술 영역이 작업하기가 어려워집니다.PDMS의 갓 제조된 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산을 소량의 실리콘 폴리머를 깨끗한 매끄러운 표면 상에 증착하여 실리콘 윈도우를 캐스팅하기 시작하고, 부피 대 면적비를 조정하여 원하는 두께를 얻는다. PDMS가 원하는 주조 표면에 증착되면 스테인레스 스틸 그리드를 실리콘으로 가볍게 눌러 동일한 조직 영역의 반복 이미징을위한 랜드 마크를 제공합니다. 기포를 제거하고 실리콘 폴리머를 탈기시키려면 코팅된 표면을 진공 데시케이터에 45분 동안 두십시오.완료되면 중합체를 섭씨 75 ~ 80도의 오븐에서 45 분 동안 경화시킵니다. 금형의 가장자리에 폴리머를 스코어링하고 포셉을 사용하여 주조에 사용되는 표면에서 경화 된 창을 부드럽게 벗겨냅니다. 마우스를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.면도된 수술 부위에 10% 부피의 포비돈 요오드 용액과 70 부피% 부피의 에탄올을 세 번 연속으로 도포하여 수술을 위해 마취된 마우스를 준비한다. 멸균 수술 현장을 유지하기 위해주의를 기울여야합니다. 그런 다음 멸균 가위와 포셉을 사용하여 늑골 아치 아래 3 밀리미터에서 오른쪽 측면을 10 밀리미터 절개하십시오.피부의 한 평방 센티미터 부분을 제거하고 두 번째 쌍의 멸균 가위와 포셉을 사용하여 피부 부분보다 약간 작은 복막 부분을 제거하십시오. 소량의 외과 용 접착제를 멸균 된 웰 플레이트에 놓고 31 게이지 주사기로 꺼내어 이미징 할 부위의 가장자리 주위의 간 표면에 적용한 다음 원하는 부위에 창을 놓고 접착제가 건조 될 때까지 약 2 분 동안 간을 단단히 고정하십시오. 복막 아래에있는 창문의 가장자리를 접은 후 복막 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 떨어 뜨린 후 포셉으로 복막을 눌러 창문에 고정시킵니다.마찬가지로, 피부를 밀어 내리기 전에 소량의 외과 용 접착제를 증착하여 복막을 밀봉 한 다음 창 가장자리 주위에 접착제를 바르면 피부가 창 위로 다시 자라지 못하게하는 림을 만듭니다. 창을 췌장에 삽입하려면 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓고 앞에서 설명한 것처럼 복막의 섹션을 제거하기 전에 왼쪽 측면을 절개하십시오. 멸균 식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 비장을 부드럽게 당겨 췌장을 시각화했습니다.축축한 면봉으로 췌장을 재배치하여 절개를 통해 더 많은 표면적을 볼 수 있도록하십시오. 췌장에 접근하면 앞에서 설명한대로 원하는 부위에 이미징 창을 삽입하고 밀봉하십시오. 유선에 접근하려면 마우스를 수핀 위치에 놓고 멸균 가위와 포셉을 사용하여 사타구니 젖꼭지 중 하나에 10 밀리미터 절개 내측을 만듭니다.유선의 위 피부의 0.5 평방 센티미터 부분을 제거한 다음 두 표면 사이에 멸균 가위를 퍼뜨려 피부에서 유선을 부드럽게 분리하여 부착을 방해합니다. 31 게이지 주사기를 사용하여 영상화 할 부위의 가장자리 주위의 유선의 표면에 소량의 외과 용 접착제를 바르십시오. 접착제가 건조 될 때까지 유선에 창문을 단단히 대고 고정하십시오.창 가장자리를 피부 아래로 접은 후 현재 피부 아래에있는 창 가장자리에 소량의 외과 용 접착제를 놓고 포셉으로 피부를 아래로 밀어 넣어 피부를 창문에 고정시킵니다. 창 가장자리 주위에 접착제를 적용하여 피부가 창 위로 다시 자라는 것을 방지하는 림을 만듭니다. 이미징 세션을 시작하기 전에 70% 에탄올에 담근 면봉으로 창문을 부드럽게 닦아 잔류 이물질로부터 창문을 청소합니다.침수 렌즈를 사용할 때는 거품을 피하면서 창문에 초음파 젤을 바르십시오. 이미징을 시작하려면 안구를 통해 초점이 맞춰진 격자를 찾아 배치합니다. 그런 다음 그리드의 바닥을 0으로 설정하여 대략적인 조직 이미징 깊이를 결정합니다.이 정보는 후속 이미징 세션에서 해당 Z-평면을 찾는 데 도움이됩니다. 여러 이미징 세션에서 동일한 위치를 식별하려면 그리드의 사각형을 참조점으로 활용합니다. 이미징 세션 중에 격자 방향과 격자 내에서 이미지화된 각 시야각의 위치를 기록해 둡니다.그리드는 이미징 세션의 성공에서 특정 그리드 영역 및 이미징 필드로 다시 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 각 이미징 세션에 이어 70% 에탄올에 담근 면봉으로 창문을 부드럽게 닦아내어 잔류 렌즈 침지 매체와 이물질을 제거한다. 실리콘 창은 시간이 지남에 따라 동적 면역 세포 침윤을 포착 할 수 있습니다.대표적인 분석은 이틀째 및 넷째 날에 리모델링된 유선조직 내의 호중구 침윤을 예시한다. 실리콘 창을 사용하면 창 삽입 후 몇 주 동안 여러 시점에서 종양을 시각화 할 수 있습니다. 200 밀리그램의 PDMS로 주조 된 창문은 일반적으로 150 밀리그램의 창문 캐스트보다 훨씬 큰 인성을 나타 냈기 때문에 외과 적 이식에 더 좋습니다.참고로, PDMS 창은 표준 유리만큼 단단하지 않았으며, 유리 창의 영 모듈러스가 PDMS보다 훨씬 컸습니다. 다른 장기에서의 창 삽입은 대부분의 마우스가 시간이 지남에 따라 체중이 계속 증가함에 따라 잘 견뎌 냈습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 접착제를 사용하여 창을 완전히 봉인하는 것입니다.이것은 감염, 조직이 건조되는 것, 창문의 변위를 방지합니다. 시술 후 실리콘 창을 통해 동형 외과 주사를 할 수 있으므로 연구원은 세포 증식, 세포 - 세포 상호 작용 및 치료 효능과 같은 다양한 주제를 연구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

연구

암 연구학

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

간세포 암종 환자를 위한 경질 접근 화학색전성

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...