Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Vi takker Rob Eifert for hans hjelp til å designe og optimalisere de laserskårne rutenettene i rustfritt stål. Dette arbeidet ble støttet av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) og midler til M.E. fra National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 og 5P01CA013106-49); CSHL og Northwell Helse; Thompson Family Foundation; Svøm over Hele Amerika; og et stipend fra Simons Foundation til CSHL. M.S. ble støttet av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Programme Training Award (T32-GM008444) og National Cancer Institute of the NIH under tildeling nummer 1F30CA253993-01. L.M. støttes av et James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. er mottaker av et Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. støttes av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research og Thompson Family Foundation. Tegneserier ble laget med Biorender.com.

Alle prosedyrer som er beskrevet ble utført i samsvar med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines og hadde blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Støping av silikonvinduet 
<ol><li>Forbered silikonpolymeren (PDMS) ved å blande baseelastomeren og herdemiddelet i et forhold på 10:1 (v/v).</li>
	<li>Kast et vindu ved å deponere en liten mengde PDMS på en steril, jevn overflate og juster volum-til-områ...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravitale bildevinduer er viktige verktøy for direkte visualisering av fysiologiske og patologiske prosesser ved cellulær oppløsning når de utfolder seg over tid. Den nye prosedyren som er beskrevet for støping og innsetting av fleksible silikonavbildningsvinduer hos mus, overvinner noen av de vanligste problemene med brukte bildevinduer (ekssudat, brudd og interferens med normal mobilitet), gir ekstra sikkerhet for musen og øker tilgjengeligheten til denne teknikken.
De mest brukte bi...

Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vev hos bedøvede dyr, gir innsikt i dynamikken i fysiologiske og patologiske hendelser ved cellulær oppløsning i intakt vev. Anvendelsene av denne teknikken varierer mye, men IVM har vært medvirkende i kreftbiologifeltet for å bidra til å belyse hvordan kreftceller invaderer vev og metastasererer, samhandler med det omkringliggende mikromiljøet og reagerer på legemidler 1,2,3. I tillegg har IVM vært nøkkelen til å fremme forståelsen av de komplekse mekanismene som styrer immunresponsen ved å gi innsikt komplementær til ex vivo profileringsmetoder (f.eks. strømningscytometri). For eksempel har intravitale bildebehandlingsforsøk avslørt detaljer om immunfunksjoner når de gjelder cellemigrasjon og cellecellekontakt og har tilbudt en plattform for å kvantisere romlig dynamikk som svar på skade eller infeksjon 4,5,6,7. Mange av disse prosessene kan også studeres gjennom histologisk farging, men bare IVM tillater sporing av dynamiske endringer. Faktisk, mens en histologisk seksjon tilbyr et øyeblikksbilde av vevet på et gitt tidspunkt, kan intravital avbildning spore intercellulære og subcellulære hendelser i samme vev over tid. Spesielt har fremgang i fluorescensmerking og utvikling av molekylære reportere gjort det mulig å korrelere molekylære hendelser med cellulær atferd, for eksempel spredning, død, motilitet og interaksjon med andre celler eller den ekstracellulære matrisen. De fleste IVM-teknikker er basert på fluorescensmikroskopi, som på grunn av lysspredning gjør avbildning av dypere vev utfordrende. Interessevevet må derfor ofte eksponeres kirurgisk med en ofte invasiv og terminal prosedyre. Således, avhengig av organstedet, kan vevet avbildes kontinuerlig i en periode som varierer fra noen få til 40 h8. Alternativt tillater kirurgisk innsetting av et permanent bildevindu bildet av det samme vevet sekvensielt over en periode på dager til uke 7,9.
Utviklingen av nye bildevinduer har blitt fremhevet som et teknologisk behov for å forbedre intravital bildebehandling ytterligere tilnærminger10. Det prototypiske intravitale bildevinduet er en metallring som inneholder en glassdeksler festet til huden med suturer11. Interferens med fri bevegelse, opphopning av ekssudat og skade på glassdekslene er vanlige problemer sett ved bruk av slike vinduer. Videre krever det prototypiske vinduet spesialisert produksjon, og den kirurgiske prosedyren kan kreve omfattende opplæring. For å løse disse problemene ble polydimetylsiloksan (PDMS), en silikonpolymer, som tidligere har blitt brukt i kranialvinduer for langvarig avbildning i hjernen12, tilpasset for bruk i mageorgan og brystkjertelavbildning. Her presenteres en detaljert metode for å generere PDMS-baserte silikonvinduer, inkludert hvordan du kaster vinduet rundt et rutenett i rustfritt stål for å gi landemerker for gjentatt bildebehandling av de samme vevsområdene. Videre er en enkel, stingfri kirurgisk prosedyre for å sette inn vinduet over bukorganer eller brystkjertelen beskrevet. Denne nye tilnærmingen overvinner noen av de vanligste problemene med bildevinduer som brukes for øyeblikket, og øker tilgjengeligheten til langsgående intravital avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

Intravital mikroskopi (IVM) muliggjør visualisering av cellebevegelse, divisjon og død ved encellet oppløsning. IVM gjennom kirurgisk innsatte bildevinduer er spesielt kraftig fordi det tillater langsgående observasjon av samme vev over dager til uker. Typiske bildevinduer består av en glassdekslelip i en biokompatibel metallramme som sutureres til musens hud. Disse vinduene kan forstyrre musenes frie bevegelse, fremkalle en sterk inflammatorisk respons, og mislykkes på grunn av knust glass eller revet suturer, hvorav noen kan nødvendiggjøre eutanasi. For å løse disse problemene ble vinduer for langsiktig abdominal organ og brystkjertelavbildning utviklet fra en tynn film av polydimetylsiloksan (PDMS), en optisk klar silikonpolymer som tidligere ble brukt til kranialavbildningsvinduer. Disse vinduene kan limes direkte til vevet, noe som reduserer tiden som trengs for innsetting. PDMS er fleksibel, noe som bidrar til holdbarheten hos mus over tid – opptil 35 dager er testet. Langsgående avbildning er avbildning av samme vevsområde under separate økter. Et rutenett i rustfritt stål ble innebygd i vinduene for å lokalisere samme region, slik at visualisering av dynamiske prosesser (som brystkjertelinvolusjon) på samme steder, dager fra hverandre. Dette silikonvinduet tillot også overvåking av enkeltforminderte kreftceller som utviklet seg til mikrometastaser over tid. Silikonvinduene som brukes i denne studien er enklere å sette inn enn metallrammede glassvinduer og forårsaker begrenset betennelse i det avbildede vevet. Videre tillater innebygde rutenett enkel sporing av samme vevsregion i gjentatte bildebehandlingsøkter.

Intravital avbildning gjennom bildevinduer kan brukes til å observere, spore og kvantifisere et bredt spekter av cellulære og molekylære hendelser ved encellet oppløsning over en periode på timer til uker. Ideelle funksjoner for et bildevindu inkluderer: a) begrenset innvirkning på musens velvære og vevets fysiologi; b) holdbarhet; c) enkelhet ved innsetting; og d) klare landemerker for gjentatt avbildning av samme region. Resultatet er et allsidig, inert silikonvindu som enkelt produseres og settes inn, og som ka...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

En tilnærming er her presentert for langsiktig intravital avbildning ved hjelp av optisk klare, silikonvinduer som kan limes direkte til vev / organ av interesse og huden. Disse vinduene er billigere og mer allsidige enn andre som for tiden brukes i feltet, og kirurgisk innsetting forårsaker begrenset betennelse og nød for dyrene.

Langsgående intravital avbildning gjennom klare silikonvinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Denne prosedyren for støping og innsetting av silikonvinduer senker de tekniske barrierene for langsgående intravital avbildning. Vår protokoll produserer solide, lett tilpasningsdyktige vinduer som er godt tolerert av dyrene. Ved hjelp av denne teknikken har vi avbildet kreft og immunceller i leveren, bukspyttkjertelen og brystkjertelen.Med minimale justeringer kan den tilpasses mange anatomiske steder og biologiske spørsmål. For de som prøver denne teknikken for første gang, kan du øve på å frigjøre små mengder lim fra sprøyten. Å bruke for mye lim vil overskygge bildefeltet og gjøre det kirurgiske området vanskelig å jobbe med.Begynn å kaste silikonvinduet ved å deponere en liten mengde nylaget silikonpolymer, polydimetylsiloksan, av PDMS, på en ren jevn overflate, og juster volum-til-arealforholdet for å få ønsket tykkelse. Når PDMS er avsatt på ønsket støpeflate, trykker du lett et rutenett i rustfritt stål inn i silikonet for å gi landemerker for gjentatt avbildning av de samme vevsområdene. For å fjerne luftboblene og degas silikonpolymeren, plasser den belagte overflaten i en vakuumdesiccator i 45 minutter.Når du er ferdig, kurere polymeren i en ovn ved 75 til 80 grader Celsius i 45 minutter. Skår polymeren på kantene av formen og bruk tang for å forsiktig skrelle de herdede vinduene fra overflaten som brukes til støping. Plasser musen på venstre lateral decubitus posisjon.Forbered den bedøvede musen for kirurgi ved å bruke 10% volum ved volum povidon jodoppløsning og 70% volum etter volum etanol tre ganger etter hverandre på det barberte kirurgiske stedet. Det må utvises forsiktighet for å opprettholde et sterilt kirurgisk felt. Deretter bruker du steril saks og tang for å lage et 10 millimeter snitt på høyre flanke ved tre millimeter under kostbuen.Fjern en 1 kvadratcentimeter del av huden og bruk et annet par steril saks og tang for å fjerne en del av bukhinnen litt mindre enn delen av huden. Deponer en liten mengde kirurgisk lim på en steril brønnplate og trekk den ut med en 31 gauge sprøyte for å påføre på overflaten av leveren rundt kantene på området som skal avbildes, plasser deretter vinduet på ønsket område, og hold det fast mot leveren i omtrent to minutter til limet har tørket. Etter å ha brettet kantene på vinduet under bukhinnen, legger du en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under bukhinnen, skyver du ned på bukhinnen med tang for å feste den til vinduet.På samme måte forsegler du bukhinnen ved å deponere en liten mengde kirurgisk lim før du skyver ned huden, og påfør deretter lim rundt kantene på vinduet for å skape en kant som forhindrer at huden vokser tilbake over vinduet. For å sette inn vinduet i bukspyttkjertelen, plasser musen på høyre lateral decubitus-posisjon, og gjør snittet på venstre flanke før du fjerner en del av bukhinnen som vist tidligere. Ved hjelp av sterile bomullspinne gjennomvåt med steril saltvann, trakk du forsiktig milten for å visualisere bukspyttkjertelen.Omplasser bukspyttkjertelen med de fuktede bomullspinnene for å gjøre mer overflateareal synlig gjennom snittet. Når bukspyttkjertelen er åpnet, setter du inn og forsegler bildevinduet på ønsket område som forklart tidligere. For å få tilgang til brystkjertelen, plasser musen i liggende stilling, og gjør en 10 millimeter snitt medial til en av de inguinale brystvortene ved hjelp av steril saks og tang.Fjern en 0,5 kvadratcentimeter del av huden over brystkjertelen, og skill deretter brystkjertelen forsiktig fra huden ved å spre den sterile saksen mellom de to overflatene for å forstyrre overholdelsen. Bruk en 31 gauge sprøyte for å påføre en liten mengde kirurgisk lim på overflaten av brystkjertelen rundt kantene av området som skal avbildes. Plasser og hold vinduet godt mot brystkjertelen til limet tørker.Etter å ha brettet kantene på vinduet under huden, legg en liten mengde kirurgisk lim på kantene av vinduet som nå er under huden, og skyv ned på huden med tang for å sikre huden til vinduet. Påfør limet rundt kantene på vinduet for å lage en kant som forhindrer at huden vokser tilbake over vinduet. Før du begynner bildebehandlingsøkten, rengjør vinduet fra rester av rusk ved å tørke det forsiktig med en bomullspinne dyppet i 70% etanol.Når du bruker en vann nedsenkningslinse, bruk ultralydgelen på vinduet og unngå bobler. Hvis du vil starte bildet, finner og plasserer du rutenettet i fokus gjennom okularene. Bestem deretter den omtrentlige vevsavbildningsdybden ved å sette bunnen av rutenettet til null.Informasjonen vil hjelpe deg med å finne det tilsvarende Z-flyet i påfølgende bildebehandlingsøkter. Hvis du vil identifisere samme sted over flere bildebehandlingsøkter, bruker du firkantene i rutenettet som et referansepunkt. Under bildebehandlingsøkten noterer du deg rutenettretningen og plasseringen av hvert synsfelt som er avbildet i rutenettet.Rutenettet kan brukes til å navigere tilbake til bestemte rutenettområder og bildefelt for å lykkes med bildebehandlingsøkter. Etter hver bildeøkt fjerner du eventuelle gjenværende linseinnlevelsesmedium og rusk ved å tørke av vinduet forsiktig med en bomullspinne dyppet i 70% etanol. Silikonvinduet gjør det mulig å fange den dynamiske immuncelleinfiltrasjonen over tid.Den representative analysen illustrerer nøytrofilinfiltrasjonen i ombyggingen av brystkjertelvevet på dag to og fire. Silikonvinduet gjør at svulster kan visualiseres på flere tidspunkter over uker etter vindusinnsetting. Vinduene med 200 milligram PDMS er generelt bedre for kirurgisk implantasjon, da de viste betydelig større seighet enn vinduene støpt med 150 milligram.Vær oppmerksom på at PDMS-vinduene ikke var så stive som standardglass, representert ved at Youngs modulus av glassvinduene var betydelig større enn PDMS. Vindusinnsettingen i forskjellige organer var godt tolerert da de fleste mus fortsatte å gå opp i vekt over tid. Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er å forsegle vinduet helt ved hjelp av lim.Dette forhindrer infeksjon, vevet tørker ut og forskyvningen av vinduet. Etter prosedyren kan ortotopiske injeksjoner gjøres gjennom silikonvinduet, slik at forskere kan studere et bredt spekter av emner, for eksempel celleproliferasjon, cellecelleinteraksjoner og terapeutisk effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Vurdere tumor Mikromiljøet av metastasering døråpning-mediert vaskulær permeabilitet forbundet med kreft Cell formidling bruker Intravital Imaging og fast vev analyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Sammenligne metastatisk klar celle nyrecelle karsinom modell etablert i mus nyre og på kylling chorioallantoic membran

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradial tilgang kjemoembolisering for hepatocellulære karsinom pasienter

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellering av hjernemetastaser gjennom intrakraniell injeksjon og magnetisk resonansavbildning

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Oppdagelse av metastatiske regulatorer ved hjelp av en rask og kvantitativ intravital chick chorioallantoic membranmodell

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...