Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
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Agradecemos a Rob Eifert por sua ajuda na concepção e otimização das grades de aço inoxidável cortadas a laser. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Câncer da CSHL (P30-CA045508) e fundos para m.E. dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; a Fundação Família Thompson; Nade através da América; e uma bolsa da Fundação Simons para a CSHL. O M.S. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e pelo National Cancer Institute of the NIH sob o prêmio número 1F30CA253993-01. L.M. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação James S. McDonnell. J.M.A. é o beneficiário de uma Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto de Pesquisa do Câncer/Irvington (Prêmio CRI #3435). O D.A.T. é apoiado pelo Laboratório Dedicado da Fundação Lustgarten para Pesquisa de Câncer Pancreático e pela Thompson Family Foundation. Desenhos animados foram criados com Biorender.com.

Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as Diretrizes Cirúrgicas do Laboratório de Cold Spring Harbor e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Laboratório de Cold Spring Harbor.
1. Fundição da janela de silicone 
<ol><li>Prepare o polímero de silicone (PDMS) misturando o elastômero base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (v/v).</li>
	<li>Lance uma janela depositando uma pequena quantidade de PDMS e...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

As janelas de imagem intravital são ferramentas importantes para visualizar diretamente processos fisiológicos e patológicos na resolução celular à medida que se desdobram ao longo do tempo. O novo procedimento descrito para fundir e inserir janelas flexíveis de imagem de silicone em camundongos supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente (exsudate, quebra e interferência com a mobilidade normal), proporciona segurança adicional para o rato e aumenta a acessibilidade desta té...

A microscopia intravital (IVM), a imagem de tecidos em animais anestesiados, oferece insights sobre a dinâmica dos eventos fisiológicos e patológicos na resolução celular em tecidos intactos. As aplicações dessa técnica variam bastante, mas o IVM tem sido fundamental no campo da biologia do câncer para ajudar a elucidar como as células cancerígenas invadem tecidos e metástases, interagem com o microambiente circundante e respondem a medicamentos 1,2,3. Além disso, o IVM tem sido fundamental para avançar na compreensão dos mecanismos complexos que regem as respostas imunológicas, fornecendo insights complementares às abordagens de perfil ex vivo (por exemplo, citometria de fluxo). Por exemplo, experimentos de imagem intravital revelaram detalhes sobre funções imunológicas no que se referem à migração celular e contato celular e ofereceram uma plataforma para quantificar a dinâmica espacial em resposta a lesões ou infecções 4,5,6,7. Muitos desses processos também podem ser estudados através de coloração histológica, mas apenas o IVM permite o rastreamento de mudanças dinâmicas. De fato, enquanto uma seção histológica oferece um instantâneo do tecido em um dado momento, a imagem intravital pode rastrear eventos intercelulares e subcelulares dentro do mesmo tecido ao longo do tempo. Em particular, o progresso na rotulagem de fluorescência e o desenvolvimento de repórteres moleculares permitiram que eventos moleculares se correlacionam com comportamentos celulares, como proliferação, morte, motilidade e interação com outras células ou a matriz extracelular. A maioria das técnicas de IVM são baseadas na microscopia de fluorescência, que devido à dispersão de luz, torna a imagem mais profunda desafiadora. O tecido de interesse, portanto, muitas vezes precisa ser exposto cirurgicamente com um procedimento muitas vezes invasivo e terminal. Assim, dependendo do local do órgão, o tecido pode ser imagedo continuamente por um período variando de poucos a 40 h8. Alternativamente, a inserção cirúrgica de uma janela permanente de imagem permite a imagem do mesmo tecido sequencialmente durante um período de dias até semanas 7,9.
O desenvolvimento de novas janelas de imagem tem sido destacado como uma necessidade tecnológica para melhorar ainda mais as abordagens de imagem intravital10. A janela de imagem intravital prototípica é um anel de metal contendo uma mancha de vidro presa à pele com suturas11. Interferências com a livre circulação, o acúmulo de exsudato e danos à tampa de vidro são problemas comuns vistos com o uso dessas janelas. Além disso, a janela prototípica requer produção especializada, e o procedimento cirúrgico pode exigir treinamento extensivo. Para resolver essas questões, o polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone, que já foi usado em janelas cranianas para imagens de longo prazo no cérebro12, foi adaptado para uso em imagens de órgãos abdominais e glândulas mamárias. Aqui, é apresentado um método detalhado para a geração de janelas de silicone baseadas em PDMS, incluindo como lançar a janela em torno de uma grade de aço inoxidável para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Além disso, é descrito um procedimento cirúrgico simples e sem pontos para inserir a janela sobre órgãos abdominais ou a glândula mamária. Esta nova abordagem supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente e aumenta a acessibilidade de imagens intravitais longitudinais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

A microscopia intravital (IVM) permite a visualização do movimento celular, divisão e morte na resolução unicelular. O IVM através de janelas de imagem cirurgicamente inseridas é particularmente poderoso porque permite a observação longitudinal do mesmo tecido durante dias a semanas. Janelas de imagem típicas compreendem uma mancha de vidro em uma estrutura metálica biocompatível suturada na pele do rato. Essas janelas podem interferir com a livre circulação dos camundongos, provocar uma forte resposta inflamatória e falhar devido a vidros quebrados ou suturas rasgadas, qualquer uma das quais pode exigir eutanásia. Para resolver essas questões, janelas para imagem de órgão abdominal de longo prazo e gland mamária foram desenvolvidas a partir de uma película fina de polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone opticamente claro anteriormente usado para janelas de imagem craniana. Essas janelas podem ser coladas diretamente nos tecidos, reduzindo o tempo necessário para a inserção. O PDMS é flexível, contribuindo para sua durabilidade em camundongos ao longo do tempo — até 35 dias foram testados. A imagem longitudinal é a imagem da mesma região tecidual durante sessões separadas. Uma rede de aço inoxidável foi incorporada dentro das janelas para localização da mesma região, permitindo a visualização de processos dinâmicos (como a involução da glândula mamária) nos mesmos locais, com dias de diferença. Esta janela de silicone também permitiu o monitoramento de células cancerígenas únicas disseminadas que se desenvolvem em micro-metástases ao longo do tempo. As janelas de silicone utilizadas neste estudo são mais simples de inserir do que janelas de vidro emolduradas em metal e causam inflamação limitada dos tecidos imaged. Além disso, as grades incorporadas permitem o rastreamento direto da mesma região tecidual em sessões de imagem repetidas.

Imagens intravitais através de janelas de imagem podem ser usadas para observar, rastrear e quantificar uma ampla gama de eventos celulares e moleculares em resolução unicelular durante um período de horas a semanas. As características ideais para uma janela de imagem incluem: a) impacto limitado no bem-estar do camundongo e na fisiologia do tecido; b) durabilidade; c) simplicidade da inserção; e d) marcos claros para imagens repetidas da mesma região. O resultado é uma janela de silicone versátil e inerte que ...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Este procedimento para fundir e inserir janelas de silicone reduz as barreiras técnicas à imagem intravital longitudinal. Nosso protocolo produz janelas resistentes e facilmente adaptáveis que são bem toleradas pelos animais. Usando essa técnica, temos câncer de imagem e células imunes no fígado, pâncreas e glândula mamária.Com ajustes mínimos, poderia ser adaptado a muitos locais anatômicos e questões biológicas. Para quem está experimentando essa técnica pela primeira vez, pratique a liberação de pequenas quantidades de cola da seringa. Aplicar muita cola irá nublar o campo de imagem e dificultar o trabalho da área cirúrgica.Comece a fundar a janela de silicone depositando uma pequena quantidade do polímero de silicone recém-preparado, polidimtilsiloxano, de PDMS, em uma superfície lisa limpa, e ajuste a razão volume/área para obter a espessura desejada. Uma vez que o PDMS é depositado na superfície de fundição desejada, pressione levemente uma grade de aço inoxidável no silicone para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Para remover as bolhas de ar e desgas o polímero de silicone, coloque a superfície revestida em um desiccador de vácuo por 45 minutos.Quando feito, cure o polímero em um forno a 75 a 80 graus Celsius por 45 minutos. Marque o polímero nas bordas do molde e use fórceps para descascar suavemente as janelas curadas da superfície usada para fundição. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral esquerdo.Prepare o camundongo anestesiado para cirurgia aplicando 10% de volume por solução de iodo povidone em volume e 70% de volume por volume de etanol três vezes consecutivamente no local cirúrgico raspado. Deve-se tomar cuidado para manter um campo cirúrgico estéril. Em seguida, use tesouras estéreis e fórceps para fazer uma incisão de 10 milímetros no flanco direito a três milímetros abaixo do arco costal.Remova uma seção de um centímetro quadrado da pele e use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele. Deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico em uma placa de poço estéril e retire-a com uma seringa de calibre 31 para aplicar na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageada, em seguida, posicione a janela na área desejada, e segure-a firmemente contra o fígado por aproximadamente dois minutos até que o adesivo tenha secado. Depois de dobrar as bordas da janela sob o peritônio depositar uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio, empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.Da mesma forma, sele o peritônio depositando uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico antes de empurrar para baixo da pele, em seguida, aplique cola ao redor das bordas da janela para criar uma borda que impedirá que a pele cresça de volta sobre a janela. Para inserir a janela no pâncreas, coloque o mouse na posição de decúbito lateral direito e faça a incisão no flanco esquerdo antes de remover uma seção do peritônio como demonstrado anteriormente. Usando cotonetes de algodão estéreis encharcados com soro fisiológico estéril, puxou suavemente o baço para visualizar o pâncreas.Reposicione o pâncreas com os cotonetes umedecidos para tornar mais área de superfície visível através da incisão. Uma vez que o pâncreas seja acessado, insira e sele a janela de imagem na área desejada, conforme explicado anteriormente. Para acessar a glândula mamária, coloque o rato na posição supina e faça uma incisão de 10 milímetros medial para um dos mamilos inguinais usando tesouras estéreis e fórceps.Remova uma seção de 0,5 centímetro quadrado da pele acima da glândula mamária e, em seguida, separe suavemente a glândula mamária da pele, espalhando a tesoura estéril entre as duas superfícies para interromper a adesão. Use uma seringa de calibre 31 para aplicar uma pequena quantidade do adesivo cirúrgico na superfície da glândula mamária ao redor das bordas da área a ser imageda. Posicione e segure a janela firmemente contra a glândula mamária até que o adesivo se adoecie.Depois de dobrar as bordas da janela sob a pele, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob a pele, e empurre para baixo na pele com fórceps para fixar a pele à janela. Aplique a cola ao redor das bordas da janela para criar uma borda que impedirá que a pele cresça de volta sobre a janela. Antes de iniciar a sessão de imagem, limpe a janela de qualquer detrito residual limpando-a suavemente com um cotonete mergulhado em 70% de etanol.Ao utilizar uma lente de imersão de água, aplique o gel de ultrassom na janela evitando bolhas. Para iniciar a imagem, localize e coloque a grade em foco através dos oculares. Em seguida, determine a profundidade aproximada da imagem do tecido, definindo a parte inferior da grade para zero.As informações ajudarão na localização do plano Z correspondente em sessões de imagem subsequentes. Para identificar o mesmo local em várias sessões de imagem, utilize os quadrados na grade como ponto de referência. Durante a sessão de imagem, observe a orientação da grade e a localização de cada campo de visão visualizado dentro da grade.A grade pode ser usada para navegar de volta para áreas específicas de grade e campos de imagem no sucesso de sessões de imagem. Após cada sessão de imagem remova qualquer meio de imersão de lente residual e detritos limpando suavemente a janela com um cotonete mergulhado em 70% de etanol. A janela de silicone permite capturar a dinâmica infiltração de células imunes ao longo do tempo.A análise representativa ilustra a infiltração de neutrófilos dentro do tecido da glândula mamária remodelante nos dias dois e quatro. A janela de silicone permite que os tumores sejam visualizados em vários pontos de tempo ao longo de semanas após a inserção da janela. As janelas fundidas com 200 miligramas de PDMS são geralmente melhores para implantação cirúrgica, pois apresentaram resistência significativamente maior do que as janelas fundidas com 150 miligramas.Note-se que as janelas PDMS não eram tão rígidas quanto o vidro padrão, representado pelo módulo young das janelas de vidro sendo significativamente maior que o PDMS. A inserção da janela em diferentes órgãos foi bem tolerada, pois a maioria dos ratos continuou a ganhar peso ao longo do tempo. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é selar totalmente a janela usando cola.Isso evita que a infecção, o tecido sequem e o deslocamento da janela. Após o procedimento, as injeções ortotópicas podem ser feitas através da janela de silicone, permitindo que os pesquisadores estudem uma grande variedade de tópicos, como proliferação celular, interações célula-células e eficácia terapêutica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Pesquisa do câncer

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Chemoembolização de acesso transradial para pacientes com carcinoma hepatocelular

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...