Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
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Agradecemos a Rob Eifert por su ayuda en el diseño y optimización de las rejillas de acero inoxidable cortadas con láser. Este trabajo fue apoyado por el CSHL Cancer Center (P30-CA045508) y fondos para M.E. de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (1R01CA2374135 y 5P01CA013106-49); CSHL y Northwell Health; la Fundación de la Familia Thompson; Nadar a través de América; y una subvención de la Fundación Simons a CSHL. M.S. fue apoyado por el National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) y el National Cancer Institute of the NIH bajo el número de premio 1F30CA253993-01. L.M. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación James S. McDonnell. J.M.A. ha recibido una beca postdoctoral del Instituto de Investigación del Cáncer/Irvington (Premio CRI #3435). D.A.T. cuenta con el apoyo del Laboratorio Dedicado a la Investigación del Cáncer de Páncreas de la Fundación Lustgarten y la Fundación de la Familia Thompson. Los dibujos animados fueron creados con Biorender.com.

Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las Pautas Quirúrgicas del Laboratorio de Cold Spring Harbor y habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio de Cold Spring Harbor.
1. Fundición de la ventana de silicona 
<ol><li>Prepare el polímero de silicona (PDMS) mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de 10: 1 (v / v).</li>
	<li>Funda una ventana depositando una pequeñ...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Las ventanas de imágenes intravitales son herramientas importantes para visualizar directamente los procesos fisiológicos y patológicos a resolución celular a medida que se desarrollan con el tiempo. El novedoso procedimiento descrito para fundir e insertar ventanas de imágenes de silicona flexibles en ratones supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente (exudado, rotura e interferencia con la movilidad normal), proporciona seguridad adicional para el ratón y aum...

La microscopía intravital (IVM), la imagen de tejidos en animales anestesiados, ofrece información sobre la dinámica de eventos fisiológicos y patológicos a resolución celular en tejidos intactos. Las aplicaciones de esta técnica varían ampliamente, pero la IVM ha sido fundamental en el campo de la biología del cáncer para ayudar a dilucidar cómo las células cancerosas invaden los tejidos y hacen metástasis, interactúan con el microambiente circundante y responden a los medicamentos 1,2,3. Además, la IVM ha sido clave para avanzar en la comprensión de los complejos mecanismos que gobiernan las respuestas inmunes al proporcionar información complementaria a los enfoques de perfiles ex vivo (por ejemplo, citometría de flujo). Por ejemplo, los experimentos de imágenes intravitales han revelado detalles sobre las funciones inmunes en relación con la migración celular y el contacto célula-célula y han ofrecido una plataforma para cuantificar la dinámica espaciotemporal en respuesta a una lesión o infección 4,5,6,7. Muchos de estos procesos también se pueden estudiar a través de la tinción histológica, pero solo la IVM permite el seguimiento de los cambios dinámicos. De hecho, mientras que una sección histológica ofrece una instantánea del tejido en un momento dado, las imágenes intravitales pueden rastrear eventos intercelulares y subcelulares dentro del mismo tejido a lo largo del tiempo. En particular, el progreso en el etiquetado de fluorescencia y el desarrollo de reporteros moleculares han permitido que los eventos moleculares se correlacionen con comportamientos celulares, como la proliferación, la muerte, la motilidad y la interacción con otras células o la matriz extracelular. La mayoría de las técnicas de IVM se basan en la microscopía de fluorescencia, que debido a la dispersión de la luz, hace que las imágenes de tejidos más profundos sean un desafío. El tejido de interés, por lo tanto, a menudo necesita ser expuesto quirúrgicamente con un procedimiento a menudo invasivo y terminal. Por lo tanto, dependiendo del sitio del órgano, el tejido se puede visualizar continuamente durante un período que varía de unos pocos a 40 h8. Alternativamente, la inserción quirúrgica de una ventana de imagen permanente permite la obtención de imágenes del mismo tejido secuencialmente durante un período de días a semanas 7,9.
El desarrollo de nuevas ventanas de imagen se ha destacado como una necesidad tecnológica para mejorar aún más los enfoques de imagen intravital10. La ventana de imagen intravital prototípica es un anillo metálico que contiene una funda de vidrio asegurada a la piel con suturas11. La interferencia con el libre movimiento, la acumulación de exudado y el daño a la cubierta de vidrio son problemas comunes que se observan con el uso de tales ventanas. Además, la ventana prototípica requiere una producción especializada, y el procedimiento quirúrgico puede requerir una capacitación extensa. Para abordar estos problemas, el polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona, que anteriormente se ha utilizado en ventanas craneales para imágenes a largo plazo en el cerebro12, se adaptó para su uso en imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias. Aquí, se presenta un método detallado para generar ventanas de silicona basadas en PDMS, que incluye cómo fundir la ventana alrededor de una rejilla de acero inoxidable para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Además, se describe un procedimiento quirúrgico simple y sin puntos de sutura para insertar la ventana sobre los órganos abdominales o la glándula mamaria. Este nuevo enfoque supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente y aumenta la accesibilidad de las imágenes intravitales longitudinales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

La microscopía intravital (IVM) permite la visualización del movimiento, la división y la muerte celular a resolución de una sola célula. La IVM a través de ventanas de imágenes insertadas quirúrgicamente es particularmente poderosa porque permite la observación longitudinal del mismo tejido durante días o semanas. Las ventanas de imágenes típicas comprenden una cubierta de vidrio en un marco de metal biocompatible suturado a la piel del ratón. Estas ventanas pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, provocar una fuerte respuesta inflamatoria y fallar debido a vidrios rotos o suturas rotas, cualquiera de las cuales puede requerir eutanasia. Para abordar estos problemas, se desarrollaron ventanas para imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias a largo plazo a partir de una película delgada de polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona ópticamente transparente utilizado anteriormente para ventanas de imágenes craneales. Estas ventanas se pueden pegar directamente a los tejidos, reduciendo el tiempo necesario para la inserción. PDMS es flexible, lo que contribuye a su durabilidad en ratones a lo largo del tiempo: se han probado hasta 35 días. Las imágenes longitudinales son imágenes de la misma región del tejido durante sesiones separadas. Se incrustó una rejilla de acero inoxidable dentro de las ventanas para localizar la misma región, lo que permitió la visualización de procesos dinámicos (como la involución de la glándula mamaria) en los mismos lugares, con días de diferencia. Esta ventana de silicona también permitió el monitoreo de células cancerosas diseminadas individuales que se convierten en micrometástasis con el tiempo. Las ventanas de silicona utilizadas en este estudio son más fáciles de insertar que las ventanas de vidrio con marco de metal y causan una inflamación limitada de los tejidos fotografiados. Además, las rejillas integradas permiten un seguimiento sencillo de la misma región del tejido en sesiones repetidas de imágenes.

Las imágenes intravitales a través de ventanas de imágenes se pueden usar para observar, rastrear y cuantificar una amplia gama de eventos celulares y moleculares a resolución de una sola célula durante un período de horas a semanas. Las características ideales para una ventana de imágenes incluyen: a) impacto limitado en el bienestar del ratón y la fisiología del tejido; b) durabilidad; c) simplicidad de inserción; y d) puntos de referencia claros para imágenes repetidas de la misma región. El resultado es ...

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Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Este procedimiento para fundir e insertar ventanas de silicona reduce las barreras técnicas para la obtención de imágenes intravitales longitudinales. Nuestro protocolo produce ventanas robustas y fácilmente adaptables que son bien toleradas por los animales. Usando esta técnica, hemos obtenido imágenes de cáncer y células inmunes en el hígado, el páncreas y la glándula mamaria.Con ajustes mínimos, podría adaptarse a muchas ubicaciones anatómicas y preguntas biológicas. Para aquellos que prueban esta técnica por primera vez, practique la liberación de pequeñas cantidades de pegamento de la jeringa. La aplicación de demasiado pegamento nublará el campo de imágenes y hará que el área quirúrgica sea difícil de trabajar.Comience a fundir la ventana de silicona depositando una pequeña cantidad del polímero de silicona recién preparado, polidimetilsiloxano, de PDMS, en una superficie lisa y limpia, y ajuste la relación volumen-área para obtener el espesor deseado. Una vez que el PDMS se deposita en la superficie de fundición deseada, presione ligeramente una rejilla de acero inoxidable en la silicona para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Para eliminar las burbujas de aire y desgasificar el polímero de silicona, coloque la superficie recubierta en un desecador al vacío durante 45 minutos.Cuando haya terminado, cure el polímero en un horno a 75 a 80 grados Celsius durante 45 minutos. Puntúe el polímero en los bordes del molde y use fórceps para pelar suavemente las ventanas curadas de la superficie utilizada para la fundición. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral izquierdo.Prepare al ratón anestesiado para la cirugía aplicando una solución de povidona yodada al 10% volumen por volumen y al etanol al 70% en volumen tres veces consecutivas en el sitio quirúrgico afeitado. Se debe tener cuidado para mantener un campo quirúrgico estéril. A continuación, use tijeras y fórceps estériles para hacer una incisión de 10 milímetros en el flanco derecho a tres milímetros por debajo del arco costal.Retire una sección de un centímetro cuadrado de la piel y use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel. Deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en una placa de pozo estéril y retírela con una jeringa de calibre 31 para aplicar en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar, luego coloque la ventana en el área deseada y manténgala firmemente contra el hígado durante aproximadamente dos minutos hasta que el adhesivo se haya secado. Después de doblar los bordes de la ventana debajo del peritoneo depositar una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo, empujar hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.Del mismo modo, selle el peritoneo depositando una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico antes de empujar hacia abajo la piel, luego aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que evitará que la piel vuelva a crecer sobre la ventana. Para insertar la ventana en el páncreas, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho y haga la incisión en el flanco izquierdo antes de extraer una sección del peritoneo como se demostró anteriormente. Usando hisopos de algodón estéril empapados con solución salina estéril, tiró suavemente del bazo para visualizar el páncreas.Reposicione el páncreas con los hisopos de algodón humedecidos para hacer que más área de superficie sea visible a través de la incisión. Una vez que se accede al páncreas, inserte y selle la ventana de imágenes en el área deseada como se explicó anteriormente. Para acceder a la glándula mamaria, coloque al ratón en posición supina y haga una incisión medial de 10 milímetros en uno de los pezones inguinales con tijeras y fórceps estériles.Retire una sección de 0,5 centímetros cuadrados de la piel por encima de la glándula mamaria, luego separe suavemente la glándula mamaria de la piel extendiendo las tijeras estériles entre las dos superficies para interrumpir la adherencia. Use una jeringa de calibre 31 para aplicar una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico en la superficie de la glándula mamaria alrededor de los bordes del área a fotografiar. Coloque y sostenga la ventana firmemente contra la glándula mamaria hasta que el adhesivo se seque.Después de doblar los bordes de la ventana debajo de la piel, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo de la piel y empuje hacia abajo la piel con fórceps para asegurar la piel a la ventana. Aplique el pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que evitará que la piel vuelva a crecer sobre la ventana. Antes de comenzar la sesión de imágenes, limpie la ventana de cualquier residuo limpiándola suavemente con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70%.Cuando utilice una lente de inmersión en agua, aplique el gel de ultrasonido en la ventana evitando burbujas. Para iniciar la imagen, localice y coloque la cuadrícula en foco a través de los oculares. A continuación, determine la profundidad aproximada de las imágenes de tejido estableciendo la parte inferior de la cuadrícula en cero.La información ayudará a localizar el plano Z correspondiente en sesiones de imágenes posteriores. Para identificar la misma ubicación en varias sesiones de imágenes, utilice los cuadrados de la cuadrícula como punto de referencia. Durante la sesión de imágenes, anote la orientación de la cuadrícula y la ubicación de cada campo de visión fotografiado dentro de la cuadrícula.La cuadrícula se puede utilizar para navegar de regreso a áreas de cuadrícula específicas y campos de imágenes en el éxito de las sesiones de imágenes. Después de cada sesión de imágenes, elimine cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiando suavemente la ventana con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70%. La ventana de silicona permite capturar la infiltración dinámica de células inmunes a lo largo del tiempo.El análisis representativo ilustra la infiltración de neutrófilos dentro del tejido de la glándula mamaria remodelante en los días dos y cuatro. La ventana de silicona permite visualizar los tumores en múltiples puntos de tiempo durante semanas después de la inserción de la ventana. Las ventanas fundidas con 200 miligramos de PDMS son generalmente mejores para la implantación quirúrgica, ya que exhibieron una dureza significativamente mayor que las ventanas fundidas con 150 miligramos.Cabe destacar que las ventanas PDMS no eran tan rígidas como el vidrio estándar, representado por el módulo de Young de las ventanas de vidrio que era significativamente mayor que el PDMS. La inserción de la ventana en diferentes órganos fue bien tolerada ya que la mayoría de los ratones continuaron aumentando de peso con el tiempo. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es sellar completamente la ventana con pegamento.Esto evita la infección, que el tejido se seque y el desplazamiento de la ventana. Después del procedimiento, las inyecciones ortotópicas se pueden realizar a través de la ventana de silicona, lo que permite a los investigadores estudiar una amplia variedad de temas, como la proliferación celular, las interacciones célula-célula y la eficacia terapéutica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

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Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

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