Name: longitudinal intravital imaging through clear silicone windows
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Vi tackar Rob Eifert för hans hjälp med att designa och optimera de laserskurna rostfria gallren. Detta arbete stöddes av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) och medel för ME från National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 och 5P01CA013106-49); CSHL och Northwell Health; Thompson Family Foundation; Simma över Amerika; och ett bidrag från Simons Foundation till CSHL. MS stöddes av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) och National Cancer Institute of the NIH under tilldelningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. stöds av ett James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. är mottagare av ett Cancer Research Institute / Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. stöds av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research och Thompson Family Foundation. Tecknade serier skapades med Biorender.com.

Alla beskrivna procedurer utfördes i enlighet med Cold Spring Harbor Laboratory Surgical Guidelines och hade godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Cold Spring Harbor Laboratory.
1. Gjutning av silikonfönstret 
<ol><li>Förbered silikonpolymeren (PDMS) genom att blanda baseastomeren och härdningsmedlet i ett förhållande 10:1 (v/v).</li>
	<li>Gjut ett fönster genom att deponera en liten mängd PDMS på en steril, slät yta och justera volym-till-yt...

<ol>
	<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+osteolytic+progression+and+therapy+response+of+cancer+lesions+in+the+bone.">Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone.</a> Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).</li><li>Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cancer+invasion+forms+an+integrin-dependent+radioresistant+niche.">Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).</li><li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2(+)+mammary+cancer.">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li><li>Eickhoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+anti-viral+immunity+requires+multiple+distinct+T+cell-dendritic+cell+interactions.">Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions.</a> Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).</li><li>Engelhardt, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).</li><li>Sammicheli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+hinder+antiviral+B+cell+responses.">Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses.</a> Science Immunology. 1 (4), (2016).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+the+wild+lives+of+immune+cells.">Recording the wild lives of immune cells.</a> Science Immunology. 3 (27), (2018).</li><li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging:+General+overview+and+technical+insights.">Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights.</a> Intravital. 3 (2), 29917 (2014).</li><li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft,+transparent,+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology.">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818 (2016).</li><li>Anderson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).</li><li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control.">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li><li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging.">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).</li><li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window.">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li></ol>

Intravitala bildfönster är viktiga verktyg för att direkt visualisera fysiologiska och patologiska processer vid cellulär upplösning när de utvecklas över tiden. Den nya proceduren som beskrivs för gjutning och insättning av flexibla silikonbildfönster hos möss övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster (exsudat, brytning och störning av normal rörlighet), ger ytterligare säkerhet för musen och ökar tillgängligheten för denna teknik.
<p class="jove_conte...

Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vävnader i bedövade djur, ger insikter i dynamiken i fysiologiska och patologiska händelser vid cellulär upplösning i intakta vävnader. Tillämpningarna av denna teknik varierar mycket, men IVM har varit avgörande inom cancerbiologiområdet för att hjälpa till att belysa hur cancerceller invaderar vävnader och metastaserar, interagerar med den omgivande mikromiljön och svarar på läkemedel 1,2,3. Dessutom har IVM varit nyckeln till att främja förståelsen av de komplexa mekanismerna som styr immunsvar genom att ge insikter som kompletterar ex vivo-profileringsmetoder (t.ex. flödescytometri). Till exempel har intravitala avbildningsexperiment avslöjat detaljer om immunfunktioner som de relaterar till cellmigration och cell-cellkontakt och har erbjudit en plattform för att kvantitera spatiotemporal dynamik som svar på skada eller infektion 4,5,6,7. Många av dessa processer kan också studeras genom histologisk färgning, men endast IVM tillåter spårning av dynamiska förändringar. Faktum är att medan en histologisk sektion erbjuder en ögonblicksbild av vävnaden vid en given tidpunkt, kan intravital avbildning spåra intercellulära och subcellulära händelser inom samma vävnad över tiden. I synnerhet har framsteg inom fluorescensmärkning och utveckling av molekylära reportrar gjort det möjligt för molekylära händelser att korreleras med cellulära beteenden, såsom proliferation, död, rörlighet och interaktion med andra celler eller den extracellulära matrisen. De flesta IVM-tekniker är baserade på fluorescensmikroskopi, vilket på grund av ljusspridning gör avbildning av djupare vävnader utmanande. Vävnaden av intresse behöver därför ofta exponeras kirurgiskt med ett ofta invasivt och terminalt förfarande. Således, beroende på organplatsen, kan vävnaden avbildas kontinuerligt under en period som varierar från några till 40 h8. Alternativt tillåter den kirurgiska införandet av ett permanent bildfönster avbildning av samma vävnad sekventiellt under en period av dagar till veckor 7,9.
Utvecklingen av nya bildfönster har lyfts fram som ett tekniskt behov av att ytterligare förbättra intravitala bildmetoder10. Det prototypiska intravitala bildfönstret är en metallring som innehåller en glasöverdragslip fäst vid huden med suturer11. Störning av fri rörlighet, ackumulering av exsudat och skador på glasöverdraget är vanliga problem som ses med att använda sådana fönster. Dessutom kräver det prototypiska fönstret specialiserad produktion, och det kirurgiska ingreppet kan kräva omfattande utbildning. För att ta itu med dessa problem anpassades polydimetylsiloxan (PDMS), en silikonpolymer, som tidigare har använts i kranialfönster för långvarig avbildning i hjärnan12, för användning i bukorgan- och bröstkörtelavbildning. Här presenteras en detaljerad metod för att generera PDMS-baserade silikonfönster, inklusive hur man gjuter fönstret runt ett rostfritt stålnät för att ge landmärken för upprepad avbildning av samma vävnadsregioner. Vidare beskrivs ett enkelt, stygnfritt kirurgiskt ingrepp för att sätta in fönstret över bukorganen eller bröstkörteln. Detta nya tillvägagångssätt övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster och ökar tillgängligheten för longitudinell intravital avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200770819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&#34; RB-2</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>N267H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>22974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia system</td>
			<td>Molecular Imaging Products Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software and sensors&#160;</td>
			<td>BIOPAC</td>
			<td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine spray&#160;</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP (MacGreen) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td>Two-part, 10:1 mixing ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72296-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender-3 Pro 3D printer</td>
			<td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far Infrared Heated blanket</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Receptor Blocker</td>
			<td>Innovex Biosciences</td>
			<td>NB309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji imaging processing package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroSpheres carboxylate, 0.04&#181;m, yellow-green (505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gating system:</td>
			<td>BIOPAC Systems Inc.</td>
			<td></td>
			<td rowspan="7">The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqknowledge software&#160;</td>
			<td></td>
			<td>ACK100W, ACK100M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff. Amp. Module, C Series&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DA100C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gating Sys small animal</td>
			<td></td>
			<td>DTU200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP160 for Windows - Analysis system</td>
			<td></td>
			<td>MP160WSW&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MouseOx Plus 120V&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MOX-120V;015000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Pad&#160;</td>
			<td></td>
			<td>TSD110&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>9031508</td>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
			<td>Two pairs; stainless steel, sharp-sharp 
			tips, straight tip, 26 mm 
			cutting edge, 11 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn on approximately 30 min 
			before use; sterilize tools at &#62;200 
			&#176;C for 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>www.bitplane.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>324912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Fluriso)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight&#174; 594</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>DL-1177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysM-eGFP mice</td>
			<td>www.mmrrc.org</td>
			<td>012039-MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5153</td>
			<td>1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip 
			width, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS MiniBionix II 808</td>
			<td>MTS Systems</td>
			<td></td>
			<td>Servohydraulic material testing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil Elastase 680 FAST probe</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV11169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>General Welding Supply Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td></td>
			<td>1.75 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>NDC17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 wound clips</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-9255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grid</td>
			<td>Fotofab</td>
			<td></td>
			<td>One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface Treated SterileTissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>Lid used as curing surface for imaging windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriM Scope Multiphoton Microscope&#160;</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: 
			T560LP 
			T665LPXXR 
			T495lxpr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200742529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal intravital imaging through clear silicone windows

Intravital mikroskopi (IVM) möjliggör visualisering av cellrörelse, delning och död vid encellsupplösning. IVM genom kirurgiskt införda bildfönster är särskilt kraftfull eftersom det möjliggör longitudinell observation av samma vävnad över dagar till veckor. Typiska bildfönster består av en glasöverdragsglas i en biokompatibel metallram suturerad till musens hud. Dessa fönster kan störa mössens fria rörlighet, framkalla ett starkt inflammatoriskt svar och misslyckas på grund av trasigt glas eller sönderrivna suturer, varav någon kan kräva eutanasi. För att ta itu med dessa problem utvecklades fönster för långvarig bukorgan- och bröstkörtelavbildning från en tunn film av polydimetylsiloxan (PDMS), en optiskt klar silikonpolymer som tidigare användes för kranialavbildningsfönster. Dessa fönster kan limmas direkt på vävnaderna, vilket minskar den tid som behövs för insättning. PDMS är flexibelt, vilket bidrar till dess hållbarhet hos möss över tid - upp till 35 dagar har testats. Longitudinell avbildning är avbildning av samma vävnadsregion under separata sessioner. Ett rostfritt stålnät var inbäddat i fönstren för att lokalisera samma region, vilket möjliggjorde visualisering av dynamiska processer (som bröstkörtelinvolution) på samma platser, med några dagars mellanrum. Detta silikonfönster möjliggjorde också övervakning av enskilda spridda cancerceller som utvecklades till mikrometastaser över tiden. Silikonfönstren som används i denna studie är enklare att sätta in än metallinramade glasfönster och orsakar begränsad inflammation i de avbildade vävnaderna. Dessutom möjliggör inbäddade rutnät enkel spårning av samma vävnadsregion i upprepade avbildningssessioner.

Intravital avbildning genom bildfönster kan användas för att observera, spåra och kvantifiera ett brett spektrum av cellulära och molekylära händelser vid encellsupplösning under en period av timmar till veckor. Idealiska funktioner för ett bildfönster inkluderar: a) begränsad inverkan på musens välbefinnande och vävnadens fysiologi; b) hållbarhet, c) enkelhet i införandet; och d) tydliga landmärken för upprepad avbildning av samma region. Resultatet är ett mångsidigt, inert silikonfönster som enkelt...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows at JoVE.com

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Ett tillvägagångssätt presenteras här för långsiktig intravital avbildning med optiskt klara silikonfönster som kan limmas direkt på vävnaden / organet av intresse och huden. Dessa fönster är billigare och mer mångsidiga än andra som för närvarande används i fältet, och den kirurgiska insättningen orsakar begränsad inflammation och nöd för djuren.

Längsgående intravital avbildning genom tydliga silikonfönster

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Denna procedur för gjutning och insättning av silikonfönster sänker de tekniska hindren för längsgående intravital avbildning. Vårt protokoll producerar robusta, lätt anpassningsbara fönster som tolereras väl av djuren. Med hjälp av denna teknik har vi avbildat cancer och immunceller i levern, bukspottkörteln och bröstkörteln.Med minimala justeringar kunde den anpassas till många anatomiska platser och biologiska frågor. För dem som försöker denna teknik för första gången, öva på att släppa små mängder lim från sprutan. Att applicera för mycket lim kommer att fördunkla bildfältet och göra det kirurgiska området svårt att arbeta med.Börja gjuta silikonfönstret genom att deponera en liten mängd av den nyberedda silikonpolymeren, polydimetylsiloxan, av PDMS, på en ren slät yta och justera förhållandet mellan volym och yta för att få önskad tjocklek. När PDMS har deponerats på önskad gjutyta, tryck lätt in ett rostfritt stålnät i silikonet för att ge landmärken för upprepad avbildning av samma vävnadsområden. För att ta bort luftbubblorna och avgas silikonpolymeren, placera den belagda ytan i en vakuumtorkator i 45 minuter.När du är klar, härda polymeren i en ugn vid 75 till 80 grader Celsius i 45 minuter. Poängsätt polymeren vid formens kanter och använd pincett för att försiktigt skala de härdade fönstren från ytan som används för gjutning. Placera musen på vänster lateral decubitusposition.Förbered den bedövade musen för operation genom att applicera 10 volymprocent povidonjodlösning och 70 volymprocent volymprocent etanol tre gånger i följd på det rakade operationsstället. Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla ett sterilt kirurgiskt fält. Använd sedan steril sax och pincett för att göra ett snitt på 10 millimeter på höger flank vid tre millimeter under kostbågen.Ta bort en del av huden på en kvadratcentimeter och använd en andra sax och pincett för att ta bort en del av bukhinnan som är något mindre än hudsektionen. Deponera en liten mängd kirurgiskt lim på en steril brunnsplatta och dra tillbaka den med en 31 gauge spruta för att applicera på leverns yta runt kanterna på det område som ska avbildas, placera sedan fönstret på önskat område och håll det stadigt mot levern i ungefär två minuter tills limet har torkat. Efter vikning av fönstrets kanter under bukhinnan deponerar en liten mängd av det kirurgiska limet på kanterna på fönstret som nu ligger under bukhinnan, tryck ner på bukhinnan med pincett för att säkra det i fönstret.På samma sätt försegla bukhinnan genom att deponera en liten mängd av det kirurgiska limet innan du trycker ner huden och applicera sedan lim runt fönstrets kanter för att skapa en kant som förhindrar att huden växer tillbaka över fönstret. För att sätta in fönstret i bukspottkörteln, placera musen på höger lateral decubitusposition och gör snittet på vänster flank innan du tar bort en del av bukhinnan som visats tidigare. Använd sterila bomullspinnar blötlagda med steril saltlösning, dra försiktigt mjälten för att visualisera bukspottkörteln.Flytta bukspottkörteln med de fuktade bomullspinnarna för att göra mer yta synlig genom snittet. När bukspottkörteln är åtkomm, sätt in och försegla bildfönstret på önskat område som förklarats tidigare. För att komma åt bröstkörteln, placera musen i ryggläge och gör ett 10 millimeter snitt medialt till en av inguinalnipplarna med steril sax och pincett.Ta bort en 0,5 kvadratcentimeter sektion av huden ovanför bröstkörteln och separera sedan försiktigt bröstkörteln från huden genom att sprida den sterila saxen mellan de två ytorna för att störa vidhäftningen. Använd en 31 gauge spruta för att applicera en liten mängd av det kirurgiska limet på ytan av bröstkörteln runt kanterna på det område som ska avbildas. Placera och håll fönstret stadigt mot bröstkörteln tills limet torkar.Efter att ha vikit kanterna på fönstret under huden, deponera en liten mängd kirurgiskt lim på kanterna på fönstret som nu är under huden och tryck ner på huden med pincett för att säkra huden i fönstret. Applicera limet runt fönstrets kanter för att skapa en kant som förhindrar att huden växer tillbaka över fönstret. Innan du börjar bildbehandlingen, rengör fönstret från eventuellt kvarvarande skräp genom att försiktigt torka av det med en bomullspinne doppad i 70% etanol.När du använder en vattennedsänkningslins, applicera ultraljudsgelen på fönstret och undvik bubblor. För att starta avbildningen, lokalisera och placera rutnätet i fokus genom okularen. Bestäm sedan det ungefärliga vävnadsavbildningsdjupet genom att ställa in botten av gallret till noll.Informationen hjälper till att lokalisera motsvarande Z-plan i efterföljande bildsessioner. Om du vill identifiera samma plats under flera bildsessioner använder du rutorna i rutnätet som referenspunkt. Under bildsessionen noterar du rutnätets orientering och platsen för varje synfält som avbildas i rutnätet.Rutnätet kan användas för att navigera tillbaka till specifika rutnätsområden och bildfält i framgången för bildsessioner. Efter varje bildsession ta bort eventuellt kvarvarande linsnedsänkningsmedium och skräp genom att försiktigt torka av fönstret med en bomullspinne doppad i 70% etanol. Silikonfönstret gör det möjligt att fånga den dynamiska immuncellsinfiltrationen över tiden.Den representativa analysen illustrerar den neutrofila infiltrationen i den ombyggda bröstkörtelvävnaden vid dag två och fyra. Silikonfönstret gör att tumörer kan visualiseras vid flera tidpunkter under veckor efter fönsterinsättning. Fönstren gjutna med 200 milligram PDMS är i allmänhet bättre för kirurgisk implantation eftersom de uppvisade betydligt större seghet än fönstren gjutna med 150 milligram.Observera att PDMS-fönstren inte var lika styva som standardglas, vilket representeras av att Youngs modul av glasfönstren var betydligt större än PDMS. Fönsterinsättningen i olika organ tolererades väl eftersom de flesta möss fortsatte att gå upp i vikt över tiden. Det viktigaste att komma ihåg när du försöker denna procedur är att försegla fönstret helt med lim.Detta förhindrar infektion, vävnaden torkar ut och förskjutningen av fönstret. Efter proceduren kan ortotopiska injektioner göras genom silikonfönstret, vilket gör det möjligt för forskare att studera en mängd olika ämnen, såsom cellproliferation, cell-cellinteraktioner och terapeutisk effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ett syngent musmodell av metastaserad njurcellscancer för kvantitativ och Longitudinal Bedömning av Prekliniska terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Längsgående morfologiska och fysiologiska övervakning av tredimensionella tumör Spheroids använder optisk koherenstomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Bedömning tumör mikromiljö av metastaser Doorway-medierad vaskulär permeabilitet i samband med Cancer Cell spridning med Intravital avbildning och fast vävnads analys

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Jämföra metastaserande clear cell njurcellscancer modell etablerad i mus njure och på kyckling chorioallantoic membranet

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradial åtkomst chemoembolization för hepatocellulära carcinom patienter

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Modellering Brain Metastaser genom intrakraniell injektion och magnetisk resonanstomografi

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

Upptäckt av metastaserade regulatorer med hjälp av en snabb och kvantitativ intravital chick chorioallantoic membranmodell

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...