Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Forsøgene blev udført på Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) fra Det Biologiske Fakultet, Bielefeld Universitet. Dette arbejde er finansieret af Bielefeld Universitet.

BEMÆRK: For følgende protokol blev der udført forbigående transfektion af protoplaster, som beskrevet tidligere12. En kort beskrivelse er angivet nedenfor.
1. Forbigående transfektion af protoplaster
<ol><li>Skær ~4 g sunde blade af Arabidopsis thaliana ecotype Columbia i 1 mm skiver og overfør dem til 20 mL enzymopløsning (1,5% cellulase; 0,4% macerozyme; 0,1% kvægserumalbumin Fraktion V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfon...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

Donorslukning og sensibiliseret acceptoremission er kendetegnet ved et lineært forhold, der giver mulighed for enten donor- eller acceptorbaseret beregning af FRET. De tilsvarende faktorer af linearitet kaldes enten G-faktor (donor til acceptor) eller xi (acceptor til donor), som er gensidige værdier4. Måling af FRET mellem fluorescerende proteiner ved fluorescensmikroskopi kræver ofte korrektioner for DSBT og ASBT på grund af de fluorescerende proteiners brede absorptions- og emissionsspektr...

Förster resonansenergioverførsel ((F)RET) observeres typisk ved fluorescensspektroskopi, selv om selve processen ikke er begrænset til at forekomme mellem fluorophorer. Den underliggende dipol-dipolkobling kræver simpelthen et lysudsende donormolekyle og en lysabsorberende acceptor. Dette er afledt af den krævede spektrale overlapning integreret J af den normaliserede donor emission og acceptor absorbans spektre1. Men fordi RET konkurrerer med fluorescens, energioverførslen bliver målbar ved ændringer i fluorescens emission: RET inducerer donor quenching og sensibiliseret acceptor emission.
Fluorophore-baserede RET er blevet kaldt fluorescens resonans energioverførsel (FRET) for at adskille det fra bioluminescens resonans energioverførsel (BRET). RET afhænger stærkt af afstanden mellem donor og acceptor, som er bredt i intervallet 0,5-10 nm2 og dermed i samme interval som proteinernes dimensioner og deres komplekser. For det andet, RET afhænger af dipol-dipol orientering kappa kvadreret. Kombineret med det faktum, at rotationsfriheden for proteinbundne fluorophorer kan overses på grund af molekylvægten og den langsomme rotationslempelse, giver RET mulighed for analyse af kropslige ændringer3.
Den såkaldte Förster radius er baseret på den spektrale overlapning integreret og bølgelængde rækkevidde af overlapning, således at rødt lysabsorberende kromohorer resultere i længere Förster radier end blå lysabsorberende farvestoffer. Da fret-målingernes dynamiske område er begrænset med 0,5 × R0 og 1,5 × R0, har FRET-parret ECFP-EYFP et dynamisk interval på 2,5-7,3 nm på grund af R0 på 4,9 nm4.
Lysstyrken af en fluorophore er givet ved produktet af dens molarudryddelseskoefficient og dens kvanteudbytte. For FRET-målinger er det fordelagtigt at vælge fluorophorer med næsten samme lysstyrke. Dette øger påvisning af donorslukning og sensibiliseret acceptor emission. Det favoriserer også kalibreringen af mikroskopisystemet. Ser man på de ofte anvendte FRET par cyan og fluorescerende proteiner, den lavere lysstyrke af cyan fluorescerende proteiner bliver indlysende (Figur 1A).
Acceptorens levetid skal dog være lavere end donorens levetid, hvilket sikrer accepterens tilgængelighed til energioverførsel. Hvis acceptorens levetid overstiger donorens levetid, kan acceptoren stadig være i ophidset tilstand, når donoren er begejstret igen. Avancerede cyan fluorescerende proteiner såsom mTurquoise viser en længere levetid og bidrager dermed til en øget sandsynlighed for FRET (Figur1B). Sandsynligheden for FRET afhænger også af acceptens molarudryddelseskoefficient.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Sensibiliserede emissionsbaserede Förster resonansenergioverførselsforsøg (FRET) udføres let, men afhænger af det mikroskopiske setup. Confocal laser scanning mikroskoper er blevet en arbejdshest for biologer. Kommercielle systemer giver høj fleksibilitet i laser effekt justering og detektor følsomhed og ofte kombinere forskellige detektorer for at opnå det perfekte billede. Sammenligningen af intensitetsbaserede data fra forskellige eksperimenter og opsætninger er imidlertid ofte umulig på grund af denne fleksibilitet. Biologvenlige procedurer er en fordel og giver mulighed for enkel og pålidelig justering af laser- og detektorindstillinger. 
Da FRET-eksperimenter i levende celler påvirkes af variationen i proteinudtryk og forholdet mellem donor-acceptor, skal proteinekspressionsniveauer overvejes til dataevaluering. Beskrevet her er en simpel protokol for pålidelige og reproducerbare FRET målinger, herunder rutiner til vurdering af protein udtryk og justering af laser intensitet og detektor indstillinger. Dataevaluering vil blive udført ved kalibrering med en fluorophor fusion af kendt FRET effektivitet. For at forbedre enkelheden er der blevet sammenlignet korrektionsfaktorer, der er opnået i celler og ved at måle rekombinante fluorescerende proteiner.

Justering af det konfokale laserscanningsmikroskop Laserjusteringen afslørede en lineær stigning i emissionen med stigende laserintensitet (figur 2 og tabel 1). Som forventet for argon-ion lasere, emissionen af 514 nm linje var meget højere end emissionen af 458 nm linje, som det fremgår af en stejlere hældning. Til efterfølgende forsøg blev lasereffekten på henholdsvis 4,5% og 6,5% valgt til 514 nm linjen og 458 nm linjen. Dette resulterede i næ...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Der er fastsat en protokol til opsætning af et standardkonfokalt laserscanningsmikroskop til in vivo Förster resonansenergioverførselsmålinger efterfulgt af dataevaluering.

Förster Resonans Energioverførsel Målinger i Levende PlanteCeller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Protokollen giver en enkel procedure for at gøre FRET eksperimenter ved sensibiliserede emissioner mere reproducerbare og sammenlignelige. Den største fordel ved FRET er målinger i realtid, så dynamiske processer kan løses. For laserjustering ved hjælp af en transmissionsfotomultiplier skal du placere den otte-brønds slide, der indeholder de transfected protoplaster under mikroskopet.Når du har valgt en tom brønd, skal du vælge linjescanningstilstand og histogramvisning, reducere laserintensiteten til et minimum og justere detektorforøgelsen til påviselig baggrundsstøj. Derefter øges laserintensiteten i trin på 0,5%, mens du optager det tilsvarende signal. For laserjustering ved hjælp af reflekterende tilstand skal du vælge en tom brønd og derefter anvende et refleksionsfilter.Tænd refleksionstilstanden, og sørg for, at detektorbølgelængdeområdet dækker laserens bølgelængde. Vælg linjescanningstilstanden og histogramvisningen, reducer laserintensiteten til et minimum, og juster detektorforøgelsen til påviselig baggrundsstøj. Flyt derefter målet til den laveste position, før du flytter det op igen, indtil refleksionen af dæksleren er synlig, og forøg derefter laserintensiteten i trin på 0,5%, mens du optager det tilsvarende signal.Til dataevaluering skal du tabulere og sortere dataene efter signalintensiteter, derefter afbilde signalintensiteterne mod den relative laserkraft og vælge laserintensiteterne, hvilket resulterer i en lignende signalintensitet. Til justering af fotomultipliers skal du vælge en tom brønd og anvende et refleksionsfilter, skifte til refleksionstilstand og sikre, at detektorbølgelængdeområdet dækker laserens bølgelængde. Vælg linjescanningstilstanden og histogramvisningen, reducer detektorforøgelsen til halvdelen af maksimumsgrænsen, og juster laserintensiteten til detekterbar baggrundsstøj.Flyt derefter målet til den laveste position, før du flytter det tilbage op, indtil refleksionen af dæksler er synlig, og forøg derefter detektorforøgelsen i 50 til 100 volt trin og registrer det tilsvarende signal. Til dataevaluering skal intensiteten afbildes i forhold til detektorgevinsten for hver detektor og derefter vælge de enkelte detektorgevinster for at opnå samme følsomhed. For billedopsamling skal du vælge de relevante filtre eller dichroiske spejle og bruge det samme dichroiske spejl til alle kanaler for at aktivere linje for linjescanning, derefter vælge et vanddypningsmål for billeddannelse af levende celler og vælge 12 eller 16 bit scanning med moderat scanningshastighed.Dernæst definere detektionsområdet helst 470 til 510 nanometer til donordetektering og 530 til 600 nanometer til acceptordetektering for FRET-par forbedret cyan fluorescerende protein eller ECFP og forbedret gult fluorescerende protein eller EYFP. Når du har anvendt detektor- og laserindstillingerne som tidligere demonstreret, skal laserintensiteten revideres baseret på det opnåede laserstrømsbord, hvis det er nødvendigt. Sørg for, at signal-til-støj-forholdet dækker hele detektorernes dynamiske område.Efter finjustering med pinhole diameter samtidig holde laser intensiteter og detektor gevinster konstant, udføre FRET målinger tager billeder af mindst 20 celler. For at bestemme krydstalekorrektionerne skal du udføre FRET-målinger med celler, der kun udtrykker donorfluoriphe, og dem, der kun udtrykker acceptorfluofen. Til kalibrering af målingerne skal der udføres FRET-målinger med celler, der udtrykker donor acceptorfusionen.Til dataevaluering skal du anskaffe linjeprofiler af cellerne, der sikrer, at hver profil ikke indeholder mere end én celle. Gem profilerne som tekstfiler. Brug derefter indstillingen til import af tekstfiler i dataafsnittet ved at importere tekstfilerne til et regneark.Læs derefter maksimumsværdierne ved at anvende max-funktionen og derefter angive de opnåede værdier i en tabel, der har en kolonne hver for donoremissions-id, FRET-emissions IF, accepteremissionS-IA og mindst fire datasæt, kun donor, accepter, donor-accepterfusion og måling. Laserjusteringen afslørede en lineær stigning i emissionen med stigende laserintensitet. Som det fremgår af en stejlere hældning, var emissionen af 514 nanometerlinjen meget højere end emissionen af 458 nanometerlinjen.Varierende detektor gevinster ved konstant laserkraft afslørede en eksponentiel adfærd for begge analyserede detektorer. Uoverensstemmelsen og den spektrale gennemblødning af donoren og acceptoren analyseret med rekombinante rensede proteiner, og som analyseres med celler, der udtrykker disse proteiner, viser, at det er umuligt at udelade bestemmelse af spektrale blødninger i levende celler, der sandsynligvis skyldes cellulære pigmenter. FRET-effektiviteten mellem de mærkede vacuolar ATPA-underenheder, VHA AECFP og VHA AEYFP faldt med stigende signalintensitet.I modsætning hertil var samspillet mellem VHA E1 ECFP og VHA CEYFP uafhængigt af signalintensiteten. Valget af passende optiske komponenter er afgørende for påvisning af donor og acceptor. Denne protokol kan også anvendes til ratiometriske sensorer i levende celler for at øge reproducerbarheden i disse eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ændre Baculovirus udtryk vektorer til at producere udskilles vegetabilske proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Fosforproteomic strategi for profilering osmotisk stress signalering i Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baseret fragmentscreening i en minimumsprøve, men maksimal automatiseringstilstand

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...