Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Les expériences ont été réalisées à la plate-forme technologique de microscopie optique (LiMiTec) de la Faculté de biologie de l’Université de Bielefeld. Ce travail a été financé par l’Université de Bielefeld.

REMARQUE: Pour le protocole suivant, une transfection transitoire des protoplastes a été effectuée, comme décrit précédemment12. Une brève description est donnée ci-dessous.
1. Transfection transitoire des protoplastes
<ol><li>Couper ~4 g de feuilles saines de l’écotype Columbia d’Arabidopsis thaliana en tranches de 1 mm et les transférer dans 20 mL de solution enzymatique (1,5 % de cellulase ; 0,4 % de macérozyme ; 0,1 % d’albumine sérique ...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

La trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisée sont caractérisées par une relation linéaire qui permet le calcul du FRET basé sur le donneur ou l’accepteur. Les facteurs de linéarité correspondants sont appelés facteur G (donneur à accepteur) ou xi (accepteur à donneur), qui sont des valeurs réciproques4. La mesure de FRET entre les protéines fluorescentes par microscopie à fluorescence nécessite souvent des corrections pour le DSBT et l’ASBT en raison des large...

Le transfert d’énergie de résonance de Förster ((F)RET) est généralement observé par spectroscopie de fluorescence, bien que le processus lui-même ne se limite pas à se produire entre les fluorophores. Le couplage dipôle-dipôle sous-jacent nécessite simplement une molécule donneuse émettant de la lumière et un accepteur absorbant la lumière. Ceci est dérivé de l’intégrale de chevauchement spectral requise J des spectres normalisés d’émission du donneur et d’absorbance de l’accepteur1. Cependant, comme le RET est en concurrence avec la fluorescence, le transfert d’énergie devient mesurable par des altérations de l’émission de fluorescence : le RET induit la trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisé.
Le RET à base de fluorophore a été appelé transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) pour le séparer du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET). Le RET dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, qui est largement comprise entre 0,5 et 10 nm2 et donc dans la même gamme que les dimensions des protéines et de leurs complexes. Deuxièmement, RET dépend de l’orientation dipôle-dipôle kappa au carré. Combiné au fait que la liberté de rotation des fluorophores liés aux protéines peut être négligée en raison du poids moléculaire et de la relaxation rotationnelle lente, RET permet l’analyse des altérations conformationnelles3.
Le rayon de Förster est basé sur l’intégrale du chevauchement spectral et la gamme de longueurs d’onde du chevauchement, de sorte que les chromophores absorbant la lumière rouge entraînent des rayons de Förster plus longs que les colorants absorbant la lumière bleue. Comme la plage dynamique des mesures FRET est limitée de 0,5 × R0 et de 1,5 × R0, la paire FRET ECFP-EYFP a une plage dynamique de 2,5 à 7,3 nm en raison de son R0 de 4,9 nm4.
La luminosité d’un fluorophore est donnée par le produit de son coefficient d’extinction molaire et de son rendement quantique. Pour les mesures FRET, il est avantageux de choisir des fluorophores de luminosité presque similaire. Cela améliore la détection de la trempe du donneur et de l’émission d’accepteurs sensibilisés. Il favorise également l’étalonnage du système de microscopie. En regardant les paires FRET fréquemment utilisées de protéines cyan et fluorescentes, la luminosité plus faible des protéines fluorescentes cyan devient évidente (Figure 1A).
Cependant, la durée de vie de l’accepteur doit être inférieure à la durée de vie du donneur, ce qui garantit la disponibilité de l’accepteur pour le transfert d’énergie. Si la durée de vie de l’accepteur dépasse la durée de vie du donneur, l’accepteur peut encore être dans l’état excité lorsque le donneur est à nouveau excité. Les protéines fluorescentes cyan avancées telles que mTurquoise montrent une durée de vie prolongée et contribuent ainsi à une probabilité accrue de FRET (Figure1B). La probabilité de FRET dépend également du coefficient d’extinction molaire de l’accepteur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Les expériences de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) basées sur des émissions sensibilisées sont faciles à réaliser, mais dépendent de la configuration microscopique. Les microscopes confocaux à balayage laser sont devenus un cheval de bataille pour les biologistes. Les systèmes commerciaux offrent une grande flexibilité dans le réglage de la puissance laser et la sensibilité du détecteur et combinent souvent différents détecteurs pour obtenir l’image parfaite. Cependant, la comparaison des données basées sur l’intensité de différentes expériences et configurations est souvent impossible en raison de cette flexibilité. Les procédures conviviales pour les biologistes sont avantageuses et permettent un réglage simple et fiable des réglages du laser et du détecteur. 
De plus, comme les expériences FRET dans des cellules vivantes sont affectées par la variabilité de l’expression des protéines et des rapports donneur-accepteur, les niveaux d’expression des protéines doivent être pris en compte pour l’évaluation des données. Décrit ici est un protocole simple pour des mesures FRET fiables et reproductibles, y compris des routines pour l’estimation de l’expression des protéines et l’ajustement de l’intensité laser et des paramètres du détecteur. L’évaluation des données sera effectuée par étalonnage avec une fusion de fluorophores de l’efficacité FRET connue. Pour améliorer la simplicité, des facteurs de correction ont été comparés qui ont été obtenus dans les cellules et en mesurant des protéines fluorescentes recombinantes.

Réglage du microscope confocal à balayage laser Le réglage laser a révélé une augmentation linéaire de l’émission avec une augmentation de l’intensité du laser (figure 2 et tableau 1). Comme prévu pour les lasers argon-ion, l’émission de la ligne de 514 nm était beaucoup plus élevée que l’émission de la ligne de 458 nm, comme en témoigne une pente plus raide. Pour les expériences ultérieures, une puissance laser de 4,5% et 6,5% a...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Un protocole est prévu pour la mise en place d’un microscope confocal à balayage laser standard pour les mesures in vivo de transfert d’énergie par résonance de Förster, suivies d’une évaluation des données.

Mesures de transfert d’énergie par résonance de Förster dans des cellules végétales vivantes

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Le protocole fournit une procédure simple pour rendre les expériences FRET par émissions sensibilisées plus reproductibles et comparables. Le principal avantage de FRET sont les mesures en temps réel afin que les processus dynamiques puissent être traités. Pour le réglage laser à l’aide d’un photomultiplicateur de transmission, placez la lame de huit puits contenant les protoplastes transfectés sous le microscope.Après avoir sélectionné un puits vide, choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, diminuez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable. Ensuite, augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% tout en enregistrant le signal correspondant. Pour le réglage laser à l’aide du mode réfléchissant, sélectionnez un puits vide, puis appliquez un filtre de réflexion.Activez le mode de réflexion et assurez-vous que la gamme de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser. Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, réduisez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable. Ensuite, déplacez l’objectif à la position la plus basse avant de le remonter jusqu’à ce que la réflexion du couvercle soit visible, puis augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% tout en enregistrant le signal correspondant.Pour l’évaluation des données, tabulez et triez les données par intensité de signal, puis tracez les intensités de signal par rapport à la puissance laser relative et choisissez les intensités laser résultant en une intensité de signal similaire. Pour le réglage des photomultiplicateurs, sélectionnez un puits vide et appliquez un filtre de réflexion, passez en mode de réflexion et assurez-vous que la plage de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser. Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, réduisez le gain du détecteur à la moitié du maximum et ajustez l’intensité du laser au bruit de fond détectable.Ensuite, déplacez l’objectif à la position la plus basse avant de le remonter jusqu’à ce que la réflexion du couvercle soit visible, puis augmentez le gain du détecteur par pas de 50 à 100 volts et enregistrez le signal correspondant. Pour l’évaluation des données, tracez l’intensité par rapport au gain du détecteur pour chaque détecteur, puis choisissez les gains individuels du détecteur pour obtenir une sensibilité similaire. Pour l’acquisition d’images, choisissez les filtres ou les miroirs dichroïques appropriés et utilisez le même miroir dichroïque pour tous les canaux afin de permettre le balayage ligne par ligne, puis sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau pour l’imagerie des cellules vivantes et choisissez le balayage 12 ou 16 bits avec une vitesse de balayage modérée.Ensuite, définissez la plage de détection de préférence 470 à 510 nanomètres pour la détection des donneurs et 530 à 600 nanomètres pour la détection des accepteurs dans le cas de la paire FRET de protéine fluorescente cyan améliorée ou ECFP et de protéine fluorescente jaune améliorée ou EYFP. Après avoir appliqué les réglages du détecteur et du laser comme démontré précédemment, révisez l’intensité du laser en fonction de la table de puissance laser obtenue si nécessaire. Assurez-vous que le rapport signal/bruit couvre toute la plage dynamique des détecteurs.Après avoir affiné le diamètre du sténopé tout en maintenant les intensités laser et les gains du détecteur constants, effectuez les mesures FRET en prenant des images d’au moins 20 cellules. Pour déterminer les corrections de diaphonie, effectuez des mesures FRET avec des cellules exprimant uniquement le fluorophore donneur et celles exprimant uniquement le fluorophore accepteur. Pour l’étalonnage des mesures, effectuez des mesures FRET avec des cellules exprimant la fusion de l’accepteur donneur.Pour l’évaluation des données, obtenez des profils linéaires des cellules en vous assurant que chaque profil ne contient pas plus d’une cellule. Enregistrez les profils sous forme de fichiers texte. Ensuite, à l’aide de l’option d’importation de fichier texte dans la section des données, importez les fichiers texte dans une feuille de calcul.Ensuite, lisez les valeurs maximales en appliquant la fonction max, puis énumérez les valeurs obtenues dans un tableau comportant chacune une colonne pour l’ID d’émission du donneur, l’émission FRET IF, l’accepteur d’émission IA et au moins quatre ensembles de données, donneur uniquement, accepteur uniquement, fusion donneur-accepteur et mesure. Le réglage laser a révélé une augmentation linéaire de l’émission avec une augmentation de l’intensité laser. Comme le montre une pente plus raide, l’émission de la ligne de 514 nanomètres était beaucoup plus élevée que l’émission de la ligne de 458 nanomètres.La variation des gains du détecteur à puissance laser constante a révélé un comportement exponentiel pour les deux détecteurs analysés. L’écart et le saignement spectral du donneur et de l’accepteur analysés avec des protéines purifiées recombinantes et analysés avec des cellules exprimant ces protéines démontrent qu’il est impossible d’omettre la détermination du saignement spectral dans les cellules vivantes probablement causées par des pigments cellulaires. L’efficacité FRET entre les sous-unités ATPA vacuolaires marquées, VHA AECFP et VHA AEYFP a diminué avec l’augmentation de l’intensité du signal.En revanche, l’interaction entre VHA E1 ECFP et VHA CEYFP était indépendante de l’intensité du signal. Le choix des composants optiques appropriés est crucial pour la détection du donneur et de l’accepteur. Ce protocole peut également être appliqué aux capteurs ratiométriques dans les cellules vivantes afin d’augmenter la reproductibilité dans ces expériences.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Recherche

Biochimie

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimétrie dissipatif pour étudier la dynamique de la liaison des phospholipides Binding Protein annexine A2 de bicouches lipidiques solide soutenu par utilisant un résonateur à Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Stratégie phosphoproteomic pour profiler la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Élimination et remplacement des ligands endogènes des protéines et allergènes liés aux lipides

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Criblage de fragments basé sur la RMN dans un échantillon minimum mais un mode d’automatisation maximal

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...