Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
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Gli esperimenti sono stati eseguiti presso la Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) della Facoltà di Biologia dell'Università di Bielefeld. Questo lavoro è stato finanziato dall'Università di Bielefeld.

NOTA: Per il seguente protocollo, è stata eseguita la trasfezione transitoria di protoplasti, come descritto in precedenza12. Di seguito è riportata una breve descrizione.
1. Trasfezione transitoria di protoplasti
<ol><li>Tagliare ~4 g di foglie sane di Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia in fette da 1 mm e trasferirle in 20 ml di soluzione enzimatica (1,5% cellulasi; 0,4% macerozima; 0,1% albumina sierica bovina Frazione V; 0,4 M mannitolo; 20 mM KCl; 20...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

L'estinzione del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati sono caratterizzate da una relazione lineare che consente il calcolo basato sul donatore o sull'accettore di FRET. I corrispondenti fattori di linearità sono chiamati fattore G (da donatore ad accettore) o xi (da accettore a donatore), che sono valori reciproci4. La misurazione del FRET tra proteine fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza richiede spesso correzioni per DSBT e ASBT a causa dell'ampio spettro di assorbimen...

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster ((F)RET) è tipicamente osservato dalla spettroscopia di fluorescenza, sebbene il processo stesso non sia limitato a verificarsi tra i fluorofori. L'accoppiamento dipolo-dipolo sottostante richiede semplicemente una molecola donatrice che emette luce e un accettore che assorbe la luce. Questo è derivato dall'integrale J di sovrapposizione spettrale richiesto degli spettri normalizzati di emissione del donatore e di assorbanza dell'accettore1. Tuttavia, poiché ret compete con la fluorescenza, il trasferimento di energia diventa misurabile dalle alterazioni dell'emissione di fluorescenza: RET induce la tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati.
Il RET a base di fluorofori è stato definito trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) per separarlo dal trasferimento di energia di risonanza di bioluminescenza (BRET). La RET dipende fortemente dalla distanza tra donatore e accettore, che è ampiamente nell'intervallo di 0,5-10 nm2 e, quindi, nello stesso intervallo delle dimensioni delle proteine e dei loro complessi. In secondo luogo, RET dipende dall'orientamento dipolo-dipolo kappa al quadrato. In combinazione con il fatto che la libertà rotazionale dei fluorofori legati alle proteine può essere trascurata a causa del peso molecolare e del lento rilassamento rotazionale, RET consente l'analisi delle alterazioni conformazionali3.
Il cosiddetto raggio di Förster si basa sull'integrale di sovrapposizione spettrale e sull'intervallo di lunghezze d'onda della sovrapposizione, in modo che i cromofori che assorbono la luce rossa producano raggi di Förster più lunghi rispetto ai coloranti che assorbono la luce blu. Poiché la gamma dinamica delle misurazioni FRET è limitata da 0,5 × R0 e 1,5 × R0, la coppia FRET ECFP-EYFP ha una gamma dinamica di 2,5-7,3 nm grazie al suo R0 di 4,9 nm4.
La luminosità di un fluoroforo è data dal prodotto del suo coefficiente di estinzione molare e dalla sua resa quantistica. Per le misurazioni FRET, è vantaggioso scegliere fluorofori di luminosità quasi simile. Ciò migliora il rilevamento della tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati. Favorisce inoltre la calibrazione del sistema di microscopia. Osservando le coppie FRET frequentemente utilizzate di proteine ciano e fluorescenti, la minore luminosità delle proteine fluorescenti ciano diventa evidente (Figura 1A).
Tuttavia, la durata dell'accettore deve essere inferiore alla durata di vita del donatore, garantendo la disponibilità dell'accettore per il trasferimento di energia. Se la vita dell'accettore supera la vita del donatore, l'accettore potrebbe essere ancora nello stato eccitato quando il donatore è di nuovo eccitato. Le proteine fluorescenti ciano avanzate come mTurquoise mostrano una durata prolungata e quindi contribuiscono ad aumentare la probabilità di FRET (Figura 1B). La probabilità di FRET dipende anche dal coefficiente di estinzione molare dell'accettore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Gli esperimenti FRET (Sensitized emission-based Förster resonance energy transfer) sono facilmente eseguibili ma dipendono dalla configurazione microscopica. I microscopi a scansione laser confocale sono diventati un cavallo di battaglia per i biologi. I sistemi commerciali offrono un'elevata flessibilità nella regolazione della potenza laser e nella sensibilità del rilevatore e spesso combinano diversi rilevatori per ottenere l'immagine perfetta. Tuttavia, il confronto dei dati basati sull'intensità di diversi esperimenti e configurazioni è spesso impossibile a causa di questa flessibilità. Le procedure di compatibilità con i biologi sono vantaggiose e consentono una regolazione semplice e affidabile delle impostazioni del laser e del rilevatore. 
Inoltre, poiché gli esperimenti FRET nelle cellule viventi sono influenzati dalla variabilità nell'espressione proteica e nei rapporti donatore-accettore, i livelli di espressione proteica devono essere considerati per la valutazione dei dati. Qui è descritto un semplice protocollo per misurazioni FRET affidabili e riproducibili, comprese le routine per la stima dell'espressione proteica e la regolazione dell'intensità del laser e delle impostazioni del rilevatore. La valutazione dei dati sarà eseguita mediante calibrazione con una fusione fluoroforica di efficienza FRET nota. Per migliorare la semplicità, sono stati confrontati i fattori di correzione che sono stati ottenuti nelle cellule e misurando le proteine fluorescenti ricombinanti.

Regolazione del microscopio a scansione laser confocale La regolazione laser ha rivelato un aumento lineare dell'emissione con l'aumentare dell'intensità del laser (Figura 2 e Tabella 1). Come previsto per i laser agli ioni di argon, l'emissione della linea a 514 nm è stata molto superiore all'emissione della linea a 458 nm, come evidenziato da una pendenza più ripida. Per gli esperimenti successivi, la potenza del laser del 4,5% e del 6,5% è stata sc...

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FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Viene fornito un protocollo per la creazione di un microscopio a scansione laser confocale standard per misure in vivo di trasferimento di energia di risonanza Förster, seguito da una valutazione dei dati.

Misurazioni del trasferimento di energia di risonanza di Förster in cellule vegetali viventi

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Il protocollo prevede una semplice procedura per rendere gli esperimenti FRET con emissioni sensibilizzate più riproducibili e comparabili. Il vantaggio principale di FRET sono le misurazioni in tempo reale in modo da poter affrontare i processi dinamici. Per la regolazione laser utilizzando un fotomoltiplicatore di trasmissione, posizionare al microscopio il vetrino a otto pozzetti contenente i protoplasti trasfettati.Dopo aver selezionato un pozzo vuoto, scegliere la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile. Quindi, aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% durante la registrazione del segnale corrispondente. Per la regolazione laser utilizzando la modalità riflettente, selezionare un pozzetto vuoto, quindi applicare un filtro di riflessione.Attivare la modalità di riflessione e assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser. Scegli la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, riduci al minimo l'intensità del laser e regola il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile. Quindi, spostare l'obiettivo nella posizione più bassa prima di spostarlo di nuovo verso l'alto fino a quando il riflesso del coverslip è visibile, quindi aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% durante la registrazione del segnale corrispondente.Per la valutazione dei dati, tabulare e ordinare i dati in base alle intensità del segnale, quindi tracciare le intensità del segnale rispetto alla potenza relativa del laser e scegliere le intensità del laser con conseguente intensità del segnale simile. Per la regolazione dei fotomoltiplicatori, selezionare un pozzo vuoto e applicare un filtro di riflessione, passare alla modalità di riflessione e assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser. Scegli la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, riduci il guadagno del rilevatore alla metà del massimo e regola l'intensità del laser per rilevare il rumore di fondo.Quindi, spostare l'obiettivo nella posizione più bassa prima di spostarlo di nuovo verso l'alto fino a quando il riflesso del coverslip è visibile, quindi aumentare il guadagno del rilevatore in passi da 50 a 100 volt e registrare il segnale corrispondente. Per la valutazione dei dati, tracciare l'intensità rispetto al guadagno del rilevatore per ciascun rivelatore, quindi scegliere i singoli guadagni del rilevatore per ottenere una sensibilità simile. Per l'acquisizione delle immagini, scegliere i filtri o gli specchi dicroici appropriati e utilizzare lo stesso specchio dicroico per tutti i canali per abilitare la scansione linea per linea, quindi selezionare un obiettivo di immersione in acqua per l'imaging di cellule vive e scegliere la scansione a 12 o 16 bit con velocità di scansione moderata.Successivamente, definire l'intervallo di rilevamento preferibilmente da 470 a 510 nanometri per il rilevamento del donatore e da 530 a 600 nanometri per il rilevamento dell'accettore nel caso della coppia FRET di proteina fluorescente ciano potenziata o ECFP e proteina fluorescente gialla potenziata o EYFP. Dopo aver applicato il rilevatore e le impostazioni laser come dimostrato in precedenza, rivedere l'intensità del laser in base alla tabella di potenza laser ottenuta, se necessario. Assicurarsi che il rapporto segnale-rumore copra l'intera gamma dinamica dei rilevatori.Dopo aver messo a punto il diametro del foro stenopeico mantenendo costanti le intensità del laser e i guadagni del rilevatore, eseguire le misurazioni FRET scattando immagini di almeno 20 celle. Per determinare le correzioni della diafonia, eseguire misurazioni FRET con le cellule che esprimono solo il fluoroforo del donatore e quelle che esprimono solo il fluoroforo accettore. Per la calibrazione delle misurazioni, eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono la fusione dell'accettore donatore.Per la valutazione dei dati, ottenere profili di linea delle celle assicurando che ogni profilo non contenga più di una cella. Salvare i profili come file di testo. Quindi, utilizzando l'opzione di importazione del file di testo nella sezione dati, importare i file di testo in un foglio di calcolo.Quindi, leggere i valori massimi applicando la funzione max, quindi elencare i valori ottenuti in una tabella con una colonna ciascuno per ID emissione donatore, emissione FRET IF, emissione accetto IA e almeno quattro set di dati, solo donatore, solo accettore, fusione donatore-accettore e misurazione. La regolazione laser ha rivelato un aumento lineare dell'emissione con l'aumentare dell'intensità del laser. Come dimostrato da una pendenza più ripida, l'emissione della linea a 514 nanometri era molto più alta dell'emissione della linea a 458 nanometri.Variare i guadagni del rivelatore a potenza laser costante ha rivelato un comportamento esponenziale per entrambi i rivelatori analizzati. La discrepanza e il sanguinamento spettrale del donatore e dell'accettore analizzati con proteine purificate ricombinanti e analizzati con cellule che esprimono tali proteine dimostra che è impossibile omettere la determinazione del sanguinamento spettrale nelle cellule viventi probabilmente causato da pigmenti cellulari. L'efficienza FRET tra le subunità ATPA vacuolari marcate, VHA AECFP e VHA AEYFP è diminuita con l'aumentare dell'intensità del segnale.Al contrario, l'interazione tra VHA E1 ECFP e VHA CEYFP era indipendente dall'intensità del segnale. La scelta di componenti ottici appropriati è fondamentale per il rilevamento del donatore e dell'accettore. Questo protocollo può anche essere applicato per sensori raziometrici in cellule viventi per aumentare la riproducibilità in questi esperimenti.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

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