Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
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실험은 생물학 학부의 빛 현미경 기술 플랫폼 (LiMiTec)에서 수행되었다, 빌레펠트 대학. 이 작품은 빌레펠트 대학에 의해 지원되었습니다.

참고: 다음 프로토콜의 경우 이전에 설명된 바와 같이 프토플라스트의 일시적인 과도 전환이 수행되었습니다12. 아래에 간단한 설명이 제공됩니다.
1. 프토플라스트의 일시적인 전환
<ol><li> 아라비도시스 탈리아나 에코타입 컬럼비아의 건강한 잎 ~4 g을 1mm 슬라이스로 자르고 효소 용액 20mL로 옮기십시오 (1.5 % 셀룰라아제; 0.4% 마메로지메; 0.1% 소 세럼 ...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

기증자 담금질 및 민감 감응수용자 방출은 FRET의 기증자 또는 수용자 기반 계산을 허용하는 선형 관계가 특징입니다. 선형의 해당 요소는 상호 값4인 G 계수(기증자를 수락자)또는 xi(기증자에 대한 수락자)라고 합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 형광 단백질 사이의 FRET를 측정하려면 형광 단백질의 광범위한 흡수 및 방출 스펙트럼으로 인해 DSBT 및 ASBT에 대한 교정이 종종 필요?...

Förster 공명 에너지 전송 (((F)RET)는 전형적으로 형광 분광법에 의해 관찰되지만, 공정 자체는 형광류 사이에서 발생하는 것으로 제한되지 않는다. 기본 이폴-이폴 커플링은 단순히 발광 기증자 분자와 빛을 흡수하는 수용자가 필요합니다. 이는 정규화된 기증자 방출 및 수용자 흡광도 스펙트럼의 필수 스펙트럼 중첩 일체형 J로부터 유래된다. 그러나 RET는 형광과 경쟁하기 때문에, 에너지 전달은 형광 방출의 변경에 의해 측정될 수 있게 됩니다: RET는 기증자의 담금질 및 감안기 방출을 유도합니다.
형광소 기반 RET는 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에서 분리하기 위해 형광 공명 에너지 전송 (FRET)이라고합니다. RET는 0.5-10 nm2 의 범위에서 널리 퍼져 있는 기증자와 수용자 사이의 거리에 크게 의존하며, 따라서 단백질과 그 복합체의 치수와 동일한 범위에서. 둘째, RET는 이폴-이폴 방향 카파 제곱에 의존한다. 단백질 에 바인딩된 형광의 회전적 자유가 분자량과 느린 회전 이완으로 인해 소홀히 할 수 있다는 사실과 결합된 RET는 형태 적 변화의 분석을 허용합니다3.
소위 Förster 반경은 스펙트럼 중첩 일체형과 겹침의 파장 범위를 기반으로하므로 적색 광 흡수 크로모포레스는 청광 흡수 염료보다 Förster radii가 더 길어집니다. FRET 측정의 동적 범위는 R0과 1.× 5 × R0으로 제한되기 때문에 FRET 쌍 ECFP-EYFP는 4.9 nm4의 R0으로 인해 2.5-7.3 nm의 동적 범위를 가지고 있습니다.
불소화의 밝기는 어금니 멸종 계수와 양자 수율의 제품에 의해 제공됩니다. FRET 측정의 경우 거의 유사한 밝기의 형광을 선택하는 것이 유리합니다. 이것은 기증자 담금질 및 감질된 수용자 방출의 탐지를 향상시킵니다. 또한 현미경 시스템의 교정을 선호합니다. 자주 사용되는 FRET 쌍의 시안 및 형광 단백질을 살펴보면 시안 형광 단백질의 낮은 밝기가 명백해집니다(그림 1A).
그러나 수용자의 수명은 기증자의 수명보다 낮아야 하며, 에너지 전달을 위한 수용자의 가용성을 보장해야 합니다. 수락자의 수명이 기증자의 수명을 초과하는 경우, 기증자가 다시 흥분할 때 수락자는 여전히 흥분 상태에있을 수 있습니다. mTurquoise와 같은 고급 시안 형광 단백질은 수명이 연장되어 FRET의 증가 확률에 기여합니다(그림1B). FRET의 확률은 또한 수용자의 어금니 소멸 계수에 따라 달라집니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

감미화 된 방출 기반 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 실험은 쉽게 수행되지만 미세한 설정에 의존합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 생물학자를위한 주력이되었다. 상용 시스템은 레이저 전력 조정 및 검출기 감도에서 높은 유연성을 제공하며 종종 다른 검출기를 결합하여 완벽한 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 유연성으로 인해 다양한 실험 및 설정에서 강도 기반 데이터를 비교하는 것은 종종 불가능합니다. 생물학자 친화적 인 절차는 장점이며 레이저 및 검출기 설정을 간단하고 신뢰할 수있는 조정할 수 있습니다. 
더욱이, 살아있는 세포에 있는 FRET 실험은 단백질 발현 및 기증자 수용자 비율에 있는 가변성에 의해 영향을 받기 때문에, 단백질 발현 수준은 데이터 평가를 위해 고려되어야 합니다. 여기에 설명된 단백질 발현 및 레이저 강도 및 검출기 설정 조정을 위한 루틴을 포함하여 안정적이고 재현 가능한 FRET 측정을 위한 간단한 프로토콜이 있습니다. 데이터 평가는 알려진 FRET 효율의 불소 융합으로 교정에 의해 수행됩니다. 단순성을 향상시키기 위해, 교정 요인은 세포에서 그리고 재조합 형광 단백질을 측정해서 얻어진 비교되었습니다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경의 조정 레이저 조정은 레이저 강도가 증가함에 따라 방출의 선형 증가를 드러냈다(그림 2 및 표 1). 아르곤 이온 레이저에 대 한 예상 대로, 514 nm 라인의 방출 458 nm 라인의 방출 보다 훨씬 높은 458 nm 라인의 방출, 가파른 경사에 의해 입증. 후속 실험의 경우, 레이저 전력은 각각 4.5%와 6.5%로 514nm 라인과 458nm 라인에 선택...

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FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

생체 내 Förster 공명 에너지 전송 측정을 위한 표준 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하고 데이터 평가를 위한 프로토콜이 제공됩니다.

살아있는 식물 세포에서 Förster 공명 에너지 전송 측정

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

이 프로토콜은 민감하게 반응된 배출에 의한 FRET 실험을 보다 재현가능하고 비교할 수 있도록 하는 간단한 절차를 제공합니다. FRET의 주요 장점은 동적 프로세스를 해결할 수 있도록 실시간으로 측정됩니다. 전송 광증을 사용하여 레이저 조정을 위해, 현미경 의 밑에 전염된 프톱서를 포함하는 8웰 슬라이드를 놓습니다.빈 우물을 선택한 후 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 레이저 강도를 최소화하고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 잡음으로 조정합니다. 다음으로, 해당 신호를 기록하는 동안 0.5 %의 단계에서 레이저 강도를 증가시다. 반사 모드를 사용하여 레이저 조정을 위해 빈 우물을 선택한 다음 반사 필터를 적용합니다.반사 모드를 전환하고 검출기 파장 범위가 레이저의 파장을 커버하도록 합니다. 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 레이저 강도를 최소화하고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 소음으로 조정합니다. 다음으로, 커버슬립의 반사가 보일 때까지 다시 이동하기 전에 목표를 가장 낮은 위치로 이동한 다음 해당 신호를 기록하는 동안 0.5%의 단계로 레이저 강도를 증가시게 한다.데이터 평가를 위해 신호 강도에 의해 데이터를 타부레이팅및 정렬한 다음 상대 레이저 전력에 대한 신호 강도를 플롯하고 레이저 강도가 유사한 신호 강도를 선택합니다. 광증의 조정을 위해 빈 우물을 선택하고 반사 필터를 적용하고 반사 모드로 전환하고 검출기 파장 범위가 레이저의 파장을 커버하도록 합니다. 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 검출기 게인을 최대절반으로 줄이고 레이저 강도를 감지가능한 배경 잡음으로 조정합니다.다음으로, 커버슬립의 반사가 보일 때까지 다시 이동하기 전에 목표를 가장 낮은 위치로 이동한 다음 검출기 게인을 50~100볼트 단계로 늘리고 해당 신호를 기록합니다. 데이터 평가의 경우 각 검출기에 대한 검출기 게인에 대한 강도를 플롯한 다음 개별 검출기 이득을 선택하여 유사한 감도를 얻습니다. 이미지 수집의 경우 적절한 필터 또는 이색 거울을 선택하고 모든 채널에 동일한 이색 거울을 사용하여 라인 스캐닝별로 라인을 활성화한 다음 라이브 셀 이미징을 위한 수분 침지 목표를 선택하고 적당한 스캐닝 속도로 12 비트 스캐닝을 선택합니다.다음으로, 기증자 검출을 위한 검출 범위를 470 내지 510 나노미터, 향상된 시안 형광 단백질 또는 ECFP의 FRET 쌍의 경우 수용자 검출을 위한 530 내지 600 나노미터를 정의하고 향상된 황형 광단백질 또는 EYFP를 정의한다. 이전에 설명한 바와 같이 검출기 및 레이저 설정을 적용한 후 필요한 경우 얻어진 레이저 파워 테이블을 기반으로 레이저 강도를 수정합니다. 신호 대 잡음 비율이 검출기의 전체 동적 범위를 커버하도록 합니다.레이저 강도와 검출기를 일정하게 유지하면서 핀홀 직경으로 미세 조정한 후, 최소 20개의 셀의 이미지를 촬영하는 FRET 측정을 수행합니다. 크로스토크 보정을 결정하기 위해, 기증자 플루오로포어만 을 표현하는 세포와 수용자 형광소만 을 표현하는 세포로 FRET 측정을 수행한다. 측정의 교정을 위해, 기증자 수용자 융합을 표현하는 세포로 FRET 측정을 수행합니다.데이터 평가의 경우 각 프로파일에 두 개 이상의 셀이 포함되어 있지 않도록 셀의 선 프로파일을 가져옵니다. 프로필을 텍스트 파일로 저장합니다. 그런 다음 데이터 섹션의 텍스트 파일 가져오기 옵션을 사용하여 텍스트 파일을 스프레드시트로 가져옵니다.다음으로 최대 함수를 적용하여 최대 값을 읽은 다음 기증자 배출 ID, FRET 배출 IF, 수락자 방출 IA 및 최소 4개의 데이터 세트, 기부자 전용, 기부자 수용자 융합 및 측정에 대한 열을 갖는 테이블에 얻은 값을 나열합니다. 레이저 조정은 레이저 강도가 증가함에 따라 방출의 선형 증가를 밝혀냈습니다. 가파른 경사면에 의해 도시된 바와 같이, 514 나노미터 선의 방출은 458 나노미터 라인의 방출보다 훨씬 높았다.일정한 레이저 전력에서 검출기 이득을 변화면 분석된 두 검출기 모두에 대한 기하급수적 동작이 밝혀졌습니다. 기증자와 수용자의 불일치 및 스펙트럼 출혈-스루-스루는 재조합 정제 단백질로 분석되고 그 단백질을 표현하는 세포로 분석된 것은 세포 안료로 인한 살아있는 세포에서 스펙트럼 출혈의 결정을 생략하는 것이 불가능하다는 것을 보여줍니다. 라벨이 부착된 바쿠올라 ATPA 서브유닛, VHA AECFP 및 VHA AEYFP 간의 FRET 효율은 신호 강도증가로 감소했습니다.대조적으로, VHA E1 ECFP와 VHA CEYFP 사이의 상호 작용은 신호 강도와 독립적이었습니다. 적절한 광학 부품의 선택은 기증자와 수용자의 검출에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 또한 이러한 실험에서 재현성을 높이기 위해 살아있는 세포에서 비율 메트릭 센서를 적용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

연구

생화학

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

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지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

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Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

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