Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Eksperimentene ble utført ved Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) ved Fakultet for biologi, Bielefeld University. Dette arbeidet er finansiert av Bielefeld University.

MERK: For følgende protokoll ble forbigående transfeksjon av protoplaster utført, som beskrevet tidligere12. En kort beskrivelse er gitt nedenfor.
1. Forbigående transfeksjon av protoplaster
<ol><li>Klipp ~ 4 g sunne blader av Arabidopsis thaliana ecotype Columbia i 1 mm skiver og overfør dem til 20 ml enzymoppløsning (1,5% cellulase; 0,4% macerozyme; 0,1% bovint serumalbumin Fraction V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonsyre (...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

Donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp er preget av et lineært forhold som gjør det mulig å enten donor- eller akseptorbasert beregning av FRET. De tilsvarende faktorene for linearitet kalles enten G-faktor (donor til akseptor) eller xi (akseptor til donor), som er gjensidige verdier4. Måling av FRET mellom fluorescerende proteiner ved fluorescensmikroskopi krever ofte korreksjoner for DSBT og ASBT på grunn av den brede absorpsjons- og utslippsspektraen til de fluorescerende proteinen...

Förster resonansenergioverføring ((F)RET) observeres vanligvis ved fluorescensspektroskopi, selv om selve prosessen ikke er begrenset til å forekomme mellom fluoroforer. Den underliggende dipol-dipolkoblingen krever ganske enkelt et lysemitterende donormolekyl og en lysabsorberende akseptor. Dette er avledet fra den nødvendige spektral overlapping integrert J av normalisert donor utslipp og akseptor absorbans spektra1. Men fordi RET konkurrerer med fluorescens, blir energioverføringen målbar ved endringer i fluorescensutslipp: RET induserer donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp.
Fluoroforbasert RET har blitt kalt fluorescensresonansenergioverføring (FRET) for å skille den fra bioluminescensresonansenergioverføring (BRET). RET avhenger sterkt av avstanden mellom donor og akseptor, som er mye i området 0,5-10 nm2 og dermed i samme område som dimensjonene til proteiner og deres komplekser. For det andre avhenger RET av dipol-dipole orientering kappa kvadrert. Kombinert med det faktum at rotasjonsfrihet av proteinbundne fluoroforer kan overses på grunn av molekylvekten og den langsomme rotasjonsavslapningen, tillater RET analyse av konformasjonsendringer3.
Den såkalte Förster-radiusen er basert på den spektrale overlappingsintegralen og bølgelengdeområdet til overlappingen, slik at røde lysabsorberende kromoforer resulterer i lengre Förster radier enn blå lysabsorberende fargestoffer. Siden det dynamiske spekteret av FRET-målinger er begrenset med 0,5 × R0 og 1,5 × R0, har FRET-paret ECFP-EYFP et dynamisk område på 2,5-7,3 nm på grunn av R0 på 4,9 nm4.
Lysstyrken til en fluorofor er gitt av produktet av sin molar utryddelseskoeffisient og kvanteutbyttet. For FRET-målinger er det fordelaktig å velge fluoroforer med nesten lik lysstyrke. Dette forbedrer påvisning av donorslukking og sensibilisert akseptorutslipp. Det favoriserer også kalibrering av mikroskopisystemet. Ser vi på de ofte brukte FRET-parene cyan og fluorescerende proteiner, blir den nedre lysstyrken til de cyan fluorescerende proteinene åpenbar (figur 1A).
Imidlertid må akseptørens levetid være lavere enn giverens levetid, noe som sikrer tilgjengeligheten av akseptoren for energioverføring. Hvis akseptørens levetid overstiger giverens levetid, kan akseptoren fortsatt være i spent tilstand når giveren er spent igjen. Avanserte cyan fluorescerende proteiner som mTurquoise viser forlenget levetid og bidrar dermed til økt sannsynlighet for FRET (figur 1B). Sannsynligheten for FRET avhenger også av akseptorens molarutryddelseskoeffisient.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Sensibiliserte utslippsbaserte Förster resonansenergioverføringseksperimenter (FRET) gjøres enkelt, men avhenger av det mikroskopiske oppsettet. Konfokale laserskanningsmikroskoper har blitt en arbeidshest for biologer. Kommersielle systemer gir høy fleksibilitet i lasereffektjustering og detektorfølsomhet og kombinerer ofte forskjellige detektorer for å oppnå det perfekte bildet. Sammenligningen av intensitetsbaserte data fra forskjellige eksperimenter og oppsett er imidlertid ofte umulig på grunn av denne fleksibiliteten. Biologvennlige prosedyrer er til fordel og gir enkel og pålitelig justering av laser- og detektorinnstillinger. 
Videre, ettersom FRET-eksperimenter i levende celler påvirkes av variasjonen i proteinuttrykk og donor-akseptorforhold, må proteinuttrykksnivåer vurderes for dataevaluering. Beskrevet her er en enkel protokoll for pålitelige og reproduserbare FRET-målinger, inkludert rutiner for estimering av proteinuttrykk og justering av laserintensitet og detektorinnstillinger. Dataevaluering vil bli utført ved kalibrering med en fluoroforfusjon av kjent FRET-effektivitet. For å forbedre enkelheten har korreksjonsfaktorer blitt sammenlignet som er oppnådd i celler og ved å måle rekombinante fluorescerende proteiner.

Justering av det kondokale laserskanningsmikroskopet Laserjusteringen avdekket en lineær økning av utslipp med økende laserintensitet (figur 2 og tabell 1). Som forventet for argon-ion lasere, utslipp av 514 NM linjen var mye høyere enn utslipp av 458 NM linjen, som det fremgår av en brattere skråning. For etterfølgende eksperimenter ble laserkraft på henholdsvis 4,5% og 6,5% valgt for henholdsvis 514 nm-linjen og 458 nm-linjen. Dette resulterte i...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

En protokoll er gitt for å sette opp et standard konfokalt laserskanningsmikroskop for in vivo Förster-resonansenergioverføringsmålinger, etterfulgt av dataevaluering.

Förster resonans energioverføringsmålinger i levende planteceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Protokollen gir en enkel prosedyre for å gjøre FRET-eksperimenter ved sensibiliserte utslipp mer reproduserbare og sammenlignbare. Den største fordelen med FRET er målinger i sanntid slik at dynamiske prosesser kan løses. For laserjustering ved hjelp av en transmisjonsfotomultiplier, plasser den åtte-brønns lysbildet som inneholder de transfekterte protoplastene under mikroskopet.Etter å ha valgt en tom brønn, velg linjeskanningsmodus og histogramvisning, reduser laserintensiteten til et minimum og juster detektorforsterkningen til påviselig bakgrunnsstøy. Deretter øker du laserintensiteten i trinn på 0,5% mens du registrerer det tilsvarende signalet. For laserjustering ved hjelp av refleksmodus, velg en tom brønn, og bruk deretter et refleksjonsfilter.Slå på refleksjonsmodus og sørg for at detektorbølgelengdeområdet dekker laserens bølgelengde. Velg linjeskanningsmodus og histogramvisning, reduser laserintensiteten til et minimum og juster detektorforsterkningen til detekterbar bakgrunnsstøy. Deretter flytter du målet til laveste posisjon før du flytter det opp igjen til refleksjonen av dekslene er synlig, og deretter øker du laserintensiteten i trinn på 0,5% mens du registrerer det tilsvarende signalet.For dataevaluering, tabulate og sorter dataene etter signalintensiteter, plott deretter signalintensitetene mot den relative laserkraften og velg laserintensitetene som resulterer i en lignende signalintensitet. For justering av fotomultipliers, velg en tom brønn og bruk et refleksjonsfilter, bytt til refleksjonsmodus og sørg for at detektorbølgelengdeområdet dekker laserens bølgelengde. Velg linjeskanningsmodus og histogramvisning, reduser detektorforsterkningen til halvparten av maksimumet og juster laserintensiteten til detekterbar bakgrunnsstøy.Deretter flytter du målet til laveste posisjon før du flytter det opp igjen til refleksjonen av dekslene er synlig, og deretter øker detektorforsterkningen i trinn på 50 til 100 volt og registrerer det tilsvarende signalet. For dataevaluering, plott intensiteten mot detektorforsterkningen for hver detektor, og velg deretter de enkelte detektorgevinstene for å oppnå lignende følsomhet. For bildeanskaffelse velger du de riktige filtrene eller dikroiske speilene og bruker det samme dikroiske speilet for alle kanaler for å aktivere linje for linjeskanning, og velg deretter et vanninnlevelsesmål for avbildning av levende celler og velg 12 eller 16-biters skanning med moderat skannehastighet.Deretter definerer du deteksjonsområdet fortrinnsvis 470 til 510 nanometer for donordeteksjon og 530 til 600 nanometer for akseptordeteksjon når det gjelder FRET-paret med forbedret cyan fluorescerende protein eller ECFP og forbedret gult fluorescerende protein eller EYFP. Etter å ha brukt detektor- og laserinnstillingene som vist tidligere, reviderer du laserintensiteten basert på det oppnådde lasereffekttabellen om nødvendig. Sørg for at signal-til-støy-forholdet dekker hele det dynamiske spekteret til detektorene.Etter finjustering med pinhole diameter mens du holder laserintensitetene og detektoren får konstant, utfør FRET-målingene som tar bilder av minst 20 celler. For å bestemme krysstalekorreksjonene, utfør FRET-målinger med celler som bare uttrykker donorfluoreore og de som bare uttrykker akseptorfluoreoren. For kalibrering av målingene, utfør FRET-målinger med celler som uttrykker donor akseptorfusjon.For dataevaluering må du hente linjeprofiler for cellene, slik at hver profil ikke inneholder mer enn én celle. Lagre profilene som tekstfiler. Deretter importerer du tekstfilene til et regneark ved hjelp av alternativet for import av tekstfiler i datadelen.Deretter leser du opp maksimumsverdiene ved å bruke maksfunksjonen, og deretter viser du de oppnådde verdiene i en tabell som har en kolonne hver for donorutslipps-ID, FRET-utslipp IF, aksepter utslipp IA og minst fire datasett, bare donor, aksepter bare, donor-aksepterfusjon og måling. Laserjusteringen viste en lineær økning i utslipp med økende laserintensitet. Som vist av en brattere skråning var utslippet av 514 nanometerlinjen mye høyere enn utslippet av 458 nanometerlinjen.Varierende detektorgevinster ved konstant lasereffekt avslørte en eksponentiell oppførsel for begge analyserte detektorer. Uoverensstemmelsen og spektralblødning av donoren og akseptoren analysert med rekombinante rensede proteiner, og som analysert med celler som uttrykker disse proteinene, viser at det er umulig å utelate bestemmelsen av spektralblødning i levende celler som sannsynligvis skyldes cellulære pigmenter. FRET-effektiviteten mellom de merkede ATPA-underenhetene, VHA AECFP og VHA AEYFP ble redusert med økende signalintensitet.Interaksjonen mellom VHA E1 ECFP og VHA CEYFP var derimot uavhengig av signalintensiteten. Valget av passende optiske komponenter er avgjørende for påvisning av donor og akseptor. Denne protokollen kan også brukes for ratiometriske sensorer i levende celler for å øke reproduserbarheten i disse eksperimentene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Fosfoproteomisk strategi for profilering av osmotisk stresssignalering i Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjerning og utskifting av endogene ligander fra Lipidbundne proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-basert fragmentscreening i et minimumsutvalg, men maksimal automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...