Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Os experimentos foram realizados na Plataforma de Tecnologia de Microscopia Leve (LiMiTec) da Faculdade de Biologia da Universidade bielefeld. Este trabalho foi financiado pela Universidade Bielefeld.

NOTA: Para o seguinte protocolo, foi realizada transfesão transitória de protoplastos, conforme descrito anteriormente12. Uma breve descrição é dada abaixo.
1. Transfecção transitória de protoplastos
<ol><li>Corte ~4 g de folhas saudáveis de Arabidopsis thaliana ecotype Columbia em fatias de 1 mm e transfira-as para 20 mL de solução enzimática (1,5% de celulase; 0,4% macerozyme; 0,1% de soro bovino albumina Fração V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 2...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

A emissão de aceitadores de doadores e sensibilizadas são caracterizadas por uma relação linear que permite o cálculo baseado em doadores ou aceitadores de FRET. Os fatores correspondentes de linearidade são chamados fator G (doador para aceitador) ou xi (aceitador ao doador), que são valores recíprocos4. Medir o FRET entre proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência muitas vezes requer correções para DSBT e ASBT devido ao amplo espectro de absorção e emissão das prote?...

A transferência de energia de ressonância förster ((F)RET) é tipicamente observada pela espectroscopia de fluorescência, embora o processo em si não se limite a ocorrer entre fluoroforos. O acoplamento dipolo-dipolo subjacente simplesmente requer uma molécula de doador emissor de luz e um aceitador absorvedor de luz. Isso é derivado da sobreposição espectral necessária J integral da emissão de doadores normalizada e espectros de absorção de aceitação1. No entanto, como o RET compete com a fluorescência, a transferência de energia torna-se mensurável por alterações na emissão de fluorescência: RET induz a extinção de doadores e emissão de aceitadores sensibilizados.
O RET baseado em fluorophore foi chamado de fluorescência resonance energy transfer (FRET) para separá-lo da transferência de energia de ressonância bioluminescência (BRET). O RET depende fortemente da distância entre doador e aceitador, que está amplamente na faixa de 0,5-10 nm2 e, portanto, na mesma faixa das dimensões das proteínas e seus complexos. Em segundo lugar, o RET depende da orientação dipolo-dipolo kappa ao quadrado. Combinado com o fato de que a liberdade rotacional de fluoroforos ligados à proteína pode ser negligenciada devido ao peso molecular e ao relaxamento rotacional lento, o RET permite a análise de alterações conformais3.
O chamado raio Förster é baseado na sobreposição espectral integral e na faixa de comprimento de onda da sobreposição, de modo que os cromóforos absorventes de luz vermelha resultam em raios de Förster mais longos do que corantes absorventes de luz azul. Como a faixa dinâmica das medições fret é limitada por 0,5 × R0 e 1,5 × R0, o par FRET ECFP-EYFP tem um alcance dinâmico de 2,5-7,3 nm devido ao seu R0 de 4,9 nm4.
O brilho de um fluoróforo é dado pelo produto de seu coeficiente de extinção molar e seu rendimento quântico. Para as medidas do FRET, é vantajoso escolher fluoroforos de brilho quase semelhante. Isso aumenta a detecção de emissão de doadores saciados e sensibilizados. Também favorece a calibração do sistema de microscopia. Olhando para os pares de proteínas cianos e fluorescentes frequentemente usados, o menor brilho das proteínas fluorescentes de ciano torna-se óbvio (Figura 1A).
No entanto, a vida útil do aceitor deve ser menor do que a vida útil do doador, garantindo a disponibilidade do aceitador para transferência de energia. Se a vida útil do aceitor exceder a vida útil do doador, o aceitador ainda pode estar no estado animado quando o doador estiver animado novamente. Proteínas fluorescentes de ciano avançado, como a mTurquoise, mostram uma vida útil prolongada e, portanto, contribuem para uma maior probabilidade de FRET (Figure1B). A probabilidade de FRET também depende do coeficiente de extinção molar do aceitador.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Os experimentos de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) baseados em emissões sensibilizadas são facilmente feitos, mas dependem da configuração microscópica. Microscópios de varredura a laser confocal tornaram-se um cavalo de trabalho para biólogos. Os sistemas comerciais oferecem alta flexibilidade no ajuste de energia a laser e sensibilidade ao detector e muitas vezes combinam diferentes detectores para obter a imagem perfeita. No entanto, a comparação de dados baseados em intensidade de diferentes experimentos e configurações é muitas vezes impossível devido a essa flexibilidade. Procedimentos amigáveis ao biólogo são vantajosos e permitem um ajuste simples e confiável das configurações de laser e detector. 
Além disso, como os experimentos de FRET em células vivas são afetados pela variabilidade na expressão proteica e nas razões de aceitação de doadores, os níveis de expressão proteica devem ser considerados para avaliação de dados. Descrito aqui é um protocolo simples para medições de FRET confiáveis e reprodutíveis, incluindo rotinas para a estimativa de expressão proteica e ajuste da intensidade do laser e configurações do detector. A avaliação dos dados será realizada por calibração com uma fusão fluoróvasa de eficiência fret conhecida. Para melhorar a simplicidade, foram comparados fatores de correção que foram obtidos nas células e medindo proteínas fluorescentes recombinantes.

Ajuste do microscópio de varredura a laser confocal O ajuste a laser revelou um aumento linear da emissão com aumento da intensidade do laser (Figura 2 e Tabela 1). Como esperado para os lasers de íons de argônio, a emissão da linha de 514 nm foi muito maior do que a emissão da linha de 458 nm, como evidenciado por uma inclinação mais íngreme. Para experimentos subsequentes, foi escolhida potência laser de 4,5% e 6,5% para a linha de 514 nm e a ...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Um protocolo é fornecido para a criação de um microscópio de varredura a laser confocal padrão para medições de transferência de energia de ressonância in vivo Förster, seguido de avaliação de dados.

Medidas de transferência de energia de ressonância förster em células vegetais vivas

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

O protocolo fornece um procedimento simples para tornar os experimentos de FRET por meio de emissões sensibilizadas mais reprodutíveis e comparáveis. A principal vantagem do FRET são as medições em tempo real para que processos dinâmicos possam ser abordados. Para ajuste a laser usando um fotomultiplier de transmissão, coloque o slide de oito poços contendo os protoplastos transfectados sob o microscópio.Depois de selecionar um poço vazio, escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruído de fundo detectável. Em seguida, aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% ao registrar o sinal correspondente. Para ajuste a laser usando o modo reflexivo, selecione um poço vazio e aplique um filtro de reflexão.Ligue o modo de reflexão e certifique-se de que o comprimento de onda do detector cubra o comprimento de onda do laser. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruído de fundo detectável. Em seguida, mova o objetivo para a posição mais baixa antes de movê-lo de volta até que o reflexo do deslizamento de cobertura seja visível, em seguida, aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% durante o registro do sinal correspondente.Para avaliação de dados, tabular e classificar os dados por intensidades de sinal, em seguida, traçar as intensidades do sinal contra a potência laser relativa e escolher as intensidades de laser resultando em uma intensidade de sinal semelhante. Para o ajuste dos fotomultipliers, selecione um poço vazio e aplique um filtro de reflexão, mude para o modo de reflexão e certifique-se de que o comprimento de onda do detector cubra o comprimento de onda do laser. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua o ganho do detector para metade do máximo e ajuste a intensidade do laser para ruído de fundo detectável.Em seguida, mova o objetivo para a posição mais baixa antes de movê-lo de volta até que o reflexo do deslizamento de cobertura seja visível, em seguida, aumente o ganho do detector em passos de 50 a 100 volts e regise o sinal correspondente. Para avaliação de dados, plote a intensidade contra o ganho do detector para cada detector e escolha os ganhos individuais do detector para obter sensibilidade semelhante. Para aquisição de imagens, escolha os filtros ou espelhosdicróicos apropriados e use o mesmo espelhodicróico para todos os canais para habilitar a varredura de linha por linha, em seguida, selecione um objetivo de imersão de água para a imagem de células vivas e escolha 12 ou 16 bits de varredura com velocidade de varredura moderada.Em seguida, defina a faixa de detecção de preferência de 470 a 510 nanômetros para detecção de doadores e de 530 a 600 nanômetros para detecção de aceitadores no caso do par DESURRE de proteína fluorescente de ciano ou ECFP e proteína fluorescente amarela aprimorada ou EYFP. Depois de aplicar as configurações do detector e do laser, como demonstrado anteriormente, revise a intensidade do laser com base na tabela de potência laser obtida, se necessário. Certifique-se de que a relação sinal-ruído cubra toda a gama dinâmica dos detectores.Após ajuste fino com o diâmetro do orifício enquanto mantém as intensidades do laser e o detector ganha constante, realize as medidas do FRET tirando imagens de pelo menos 20 células. Para determinar as correções do crosstalk, realize as medições de FRET com células expressando apenas o fluoróforo doador e aqueles que expressam apenas o fluorophore aceitador. Para calibração das medições, realize medições de FRET com células expressando a fusão aceitadora do doador.Para avaliação de dados, obtenha perfis de linha das células garantindo que cada perfil não contenha mais do que uma célula. Salve os perfis como arquivos de texto. Em seguida, usando a opção de importação de arquivos de texto na seção de dados, importe os arquivos de texto em uma planilha.Em seguida, leia os valores máximos aplicando a função máxima, em seguida, liste os valores obtidos em uma tabela com uma coluna cada para ID de emissão de doadores, Emissão DE FRET IF, emissão de aceitador IA, e pelo menos quatro conjuntos de dados, apenas doadores, apenas aceitador, fusão e medição de doadores- aceitador. O ajuste a laser revelou um aumento linear da emissão com aumento da intensidade do laser. Como mostrado por uma inclinação mais íngreme, a emissão da linha de 514 nanômetros foi muito maior do que a emissão da linha de 458 nanômetros.A variação dos ganhos do detector com energia laser constante revelou um comportamento exponencial para ambos os detectores analisados. A discrepância e o sangramento espectral do doador e do aceitador analisados com proteínas purificadas recombinantes e que analisadas com células expressando essas proteínas demonstram que é impossível omitir a determinação do sangramento espectral em células vivas provavelmente causadas por pigmentos celulares. A eficiência do FRET entre as subunidades atpa vacuolar rotuladas, VHA AECFP e VHA AEYFP diminuiu com o aumento da intensidade do sinal.Em contraste, a interação entre VHA E1 ECFP e VHA CEYFP foi independente da intensidade do sinal. A escolha de componentes ópticos adequados é crucial para a detecção do doador e do aceitador. Este protocolo também pode ser aplicado para sensores ratiométricos em células vivas para aumentar a reprodutibilidade nesses experimentos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Bioquímica

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Remoção e Substituição de Ligantes Endógenos de Proteínas e Alérgenos Lipid-Bound

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...