Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Эксперименты проводились на технологической платформе световой микроскопии (LiMiTec) биологического факультета Билефельдского университета. Эта работа была профинансирована Билефельдским университетом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующего протокола была выполнена транзиторная трансфекция протопластов, как описано ранее12. Краткое описание приведено ниже.
1. Транзиторная трансфекция протопластов
<ol><li>Нарежьте ~4 г здоровых листьев Arabidopsis thaliana экотипа Columbia на лом...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

Закалка донором и сенсибилизированная акцепторная эмиссия характеризуются линейной зависимостью, которая позволяет проводить расчет FRET на основе донора или акцептора. Соответствующие факторы линейности называются либо G-фактором (донор к акцептору), либо xi (акцептор к донору), которы?...

Резонансный перенос энергии Фёрстера ((F)RET) обычно наблюдается с помощью флуоресцентной спектроскопии, хотя сам процесс не ограничивается происходящим между флуорофорами. Лежащая в основе диполь-дипольная связь просто требует светоизлучающей донорской молекулы и светопоглощающего акцептора. Это получено из требуемого спектрального перекрытия интеграла J нормализованных спектров излучения донора и акцепторного поглощения1. Однако, поскольку RET конкурирует с флуоресценцией, передача энергии становится измеримой за счет изменений в флуоресцентном излучении: RET вызывает закалку донора и сенсибилизированную акцепторную эмиссию.
RET на основе флуорофора был назван флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET), чтобы отделить его от биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET). RET сильно зависит от расстояния между донором и акцептором, которое широко находится в диапазоне 0,5-10 нм2 и, таким образом, в том же диапазоне, что и размеры белков и их комплексов. Во-вторых, RET зависит от дипольно-дипольной ориентации каппа в квадрате. В сочетании с тем, что вращательной свободой связанных с белком флуорофоров можно пренебречь из-за молекулярной массы и медленной вращательной релаксации, RET позволяет анализировать конформационные изменения3.
Так называемый радиус Фёрстера основан на спектральном интеграле перекрытия и диапазоне длин волн перекрытия, так что красные хромофоры, поглощающие свет, приводят к более длинным радиусам Фёрстера, чем поглощающие синий свет красители. Поскольку динамический диапазон измерений FRET ограничен 0,5 × R0 и 1,5 × R0, пара FRET ECFP-EYFP имеет динамический диапазон 2,5-7,3 нм благодаря своему R0 4,9 нм4.
Яркость флуорофора задается произведением его коэффициента молярного вымирания и его квантового выхода. Для измерений FRET выгодно выбирать флуорофоры почти одинаковой яркости. Это улучшает обнаружение закалки доноров и сенсибилизированного акцепторного излучения. Это также способствует калибровке системы микроскопии. Глядя на часто используемые пары FRET синих и флуоресцентных белков, становится очевидной более низкая яркость синих флуоресцентных белков (рисунок 1A).
Однако срок службы акцептора должен быть ниже срока службы донора, обеспечивая доступность акцептора для передачи энергии. Если срок службы акцептора превышает срок службы донора, акцептор все еще может находиться в возбужденном состоянии, когда донор снова возбуждается. Усовершенствованные голубые флуоресцентные белки, такие как mTurquoise, показывают увеличенное время жизни и, таким образом, способствуют увеличению вероятности FRET (рисунок 1B). Вероятность FRET также зависит от коэффициента молярного вымирания акцептора.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Эксперименты с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) на основе сенсибилизированного излучения легко выполняются, но зависят от микроскопической установки. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы стали рабочей лошадкой для биологов. Коммерческие системы обеспечивают высокую гибкость в регулировке мощности лазера и чувствительности детектора и часто объединяют различные детекторы для получения идеального изображения. Однако сравнение данных, основанных на интенсивности, из разных экспериментов и установок часто невозможно из-за этой гибкости. Удобные для биологов процедуры являются преимуществом и позволяют легко и надежно настраивать настройки лазера и детектора. 
Кроме того, поскольку эксперименты FRET в живых клетках зависят от изменчивости экспрессии белка и соотношения донор-акцептор, для оценки данных необходимо учитывать уровни экспрессии белка. Здесь описан простой протокол для надежных и воспроизводимых измерений FRET, включая процедуры оценки экспрессии белка и регулировки интенсивности лазера и настроек детектора. Оценка данных будет проводиться путем калибровки с флуорофорным слиянием известной эффективности FRET. Для повышения простоты сравнивались поправочные коэффициенты, полученные в клетках и путем измерения рекомбинантных флуоресцентных белков.

Настройка конфокального лазерно-сканирующего микроскопа Лазерная регулировка выявила линейное увеличение излучения с увеличением интенсивности лазера (рис. 2 и табл. 1). Как и ожидалось для аргон-ионных лазеров, излучение линии 514 нм было намного выш?...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Предусмотрен протокол для установки стандартного конфокального лазерного сканирующего микроскопа для измерений резонансной передачи энергии in vivo Förster с последующей оценкой данных.

Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Протокол предусматривает простую процедуру, позволяющую сделать эксперименты FRET с помощью сенсибилизированных выбросов более воспроизводимыми и сопоставимыми. Основным преимуществом FRET являются измерения в режиме реального времени, так что динамические процессы могут быть решены. Для лазерной регулировки с помощью пропускающего фотоумножителя поместите под микроскоп восьмилуночный слайд, содержащий трансфектированные протопласты.После выбора пустого колодца выберите режим сканирования линии и вид гистограммы, уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте коэффициент усиления детектора до обнаруживаемого фонового шума. Далее увеличивайте интенсивность лазера с шагом 0,5% при записи соответствующего сигнала. Для лазерной регулировки с помощью отражающего режима выберите пустой колодец, затем примените фильтр отражения.Включите режим отражения и убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера. Выберите режим линейного сканирования и вид гистограммы, уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте усиление детектора до обнаруживаемого фонового шума. Затем переместите объектив в самое низкое положение, прежде чем переместить его обратно вверх, пока не будет видно отражение крышки, затем увеличьте интенсивность лазера с шагом 0,5% при записи соответствующего сигнала.Для оценки данных сведите в таблицу и отсортируйте данные по интенсивности сигнала, затем постройте график интенсивности сигнала относительной мощности лазера и выберите интенсивность лазера, приводящую к аналогичной интенсивности сигнала. Для регулировки фотоумножителей выберите пустую скважину и примените фильтр отражения, переключитесь в режим отражения и убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера. Выберите режим линейного сканирования и вид гистограммы, уменьшите коэффициент усиления детектора до половины максимального и отрегулируйте интенсивность лазера до обнаруживаемого фонового шума.Затем переместите объектив в самое низкое положение, прежде чем переместить его обратно вверх, пока не будет видно отражение крышки, затем увеличьте коэффициент усиления детектора с шагом от 50 до 100 вольт и запишите соответствующий сигнал. Для оценки данных постройте график интенсивности по отношению к усилению детектора для каждого детектора, а затем выберите отдельный коэффициент усиления детектора для получения аналогичной чувствительности. Для получения изображения выберите соответствующие фильтры или дихроичные зеркала и используйте одно и то же дихроичное зеркало для всех каналов, чтобы включить построчное сканирование, затем выберите объект погружения в воду для визуализации живых клеток и выберите 12- или 16-битное сканирование с умеренной скоростью сканирования.Далее определяют диапазон обнаружения предпочтительно от 470 до 510 нанометров для обнаружения донора и от 530 до 600 нанометров для акцепторного обнаружения в случае пары FRET усиленного голубого флуоресцентного белка или ECFP и усиленного желтого флуоресцентного белка или EYFP. После применения детектора и настроек лазера, как показано ранее, при необходимости пересмотрите интенсивность лазера на основе полученной таблицы мощности лазера. Убедитесь, что отношение сигнал/шум охватывает весь динамический диапазон детекторов.После тонкой настройки с диаметром точечного отверстия, сохраняя при этом интенсивность лазера и постоянное усиление детектора, выполните измерения FRET, получая изображения не менее 20 ячеек. Чтобы определить перекрестные коллизионные коррекции, выполните измерения FRET с клетками, экспрессирующими только донорский флуорофор, и только с клетками, экспрессирующими акцепторный флуорофор. Для калибровки измерений выполните измерения FRET с клетками, экспрессирующими слияние донорского акцептора.Для оценки данных получите линейные профили ячеек, гарантируя, что каждый профиль содержит не более одной ячейки. Сохраните профили в виде текстовых файлов. Затем, используя опцию импорта текстовых файлов в разделе данных, импортируйте текстовые файлы в электронную таблицу.Затем считайте максимальные значения, применив функцию max, затем перечислите полученные значения в таблице, имеющей столбец для идентификатора выбросов донора, излучения FRET IF, акцептора излучения IA и по крайней мере четырех наборов данных, только донор, только акцептор, слияние донор-акцептор и измерение. Лазерная регулировка выявила линейное увеличение излучения с увеличением интенсивности лазера. Как показал более крутой склон, выброс 514-нанометровой линии был намного выше, чем выброс 458-нанометровой линии.Изменение коэффициента усиления детектора при постоянной мощности лазера выявило экспоненциальное поведение для обоих анализируемых детекторов. Несоответствие и спектральное кровотечение донора и акцептора, проанализированных с рекомбинантными очищенными белками и проанализированных с клетками, экспрессирующими эти белки, показывает, что невозможно опустить определение спектрального кровотечения в живых клетках, вероятно, вызванного клеточными пигментами. Эффективность FRET между мечеными вакуолярными субъединицами ATPA, VHA AECFP и VHA AEYFP снижалась с увеличением интенсивности сигнала.Напротив, взаимодействие между VHA E1 ECFP и VHA CEYFP не зависело от интенсивности сигнала. Выбор соответствующих оптических компонентов имеет решающее значение для обнаружения донора и акцептора. Этот протокол также может быть применен для ратиометрических датчиков в живых клетках для повышения воспроизводимости в этих экспериментах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Фосфопротеомная стратегия профилирования осмотического стресса Сигнализация в Арабидопсис

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Скрининг фрагментов на основе ЯМР в режиме минимальной выборки, но максимальной автоматизации

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...