Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
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Los experimentos se realizaron en la Plataforma de Tecnología de Microscopía de Luz (LiMiTec) de la Facultad de Biología de la Universidad de Bielefeld. Este trabajo ha sido financiado por la Universidad de Bielefeld.

NOTA: Para el siguiente protocolo, se realizó la transfección transitoria de protoplastos, como se describió anteriormente12. A continuación se ofrece una breve descripción.
1. Transfección transitoria de protoplastos
<ol><li>Cortar ~4 g de hojas sanas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia en rodajas de 1 mm y transferirlas a 20 mL de solución enzimática (1,5% celulasa; 0,4% macerozima; 0,1% de albúmina sérica bovina Fracción V; 0,4 M de manitol...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. 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N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

El enfriamiento del donante y la emisión sensibilizada del aceptor se caracterizan por una relación lineal que permite el cálculo del FRET basado en el donante o el aceptor. Los factores correspondientes de linealidad se denominan factor G (donante a aceptor) o xi (aceptor a donante), que son valores recíprocos4. La medición de FRET entre proteínas fluorescentes por microscopía de fluorescencia a menudo requiere correcciones para DSBT y ASBT debido a los amplios espectros de absorción y em...

La transferencia de energía de resonancia de Förster ((F)RET) se observa típicamente mediante espectroscopia de fluorescencia, aunque el proceso en sí no se limita a ocurrir entre fluoróforos. El acoplamiento dipolo-dipolo subyacente simplemente requiere una molécula donante emisora de luz y un aceptor que absorba la luz. Esto se deriva de la superposición espectral requerida integral J de los espectros normalizados de emisión y absorbancia aceptora del donante1. Sin embargo, debido a que RET compite con la fluorescencia, la transferencia de energía se vuelve medible por alteraciones en la emisión de fluorescencia: RET induce el enfriamiento del donante y la emisión del aceptor sensibilizado.
El RET basado en fluoróforos se ha denominado transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para separarla de la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET). RET depende en gran medida de la distancia entre el donante y el aceptor, que está ampliamente en el rango de 0.5-10 nm2 y, por lo tanto, en el mismo rango que las dimensiones de las proteínas y sus complejos. En segundo lugar, RET depende de la orientación dipolo-dipolo kappa al cuadrado. Combinado con el hecho de que la libertad rotacional de los fluoróforos unidos a proteínas puede ser descuidada debido al peso molecular y la lenta relajación rotacional, RET permite el análisis de alteraciones conformacionales3.
El llamado radio de Förster se basa en la integral de superposición espectral y el rango de longitud de onda de la superposición, de modo que los cromóforos que absorben la luz roja dan como resultado radios de Förster más largos que los tintes que absorben la luz azul. Como el rango dinámico de las mediciones FRET está limitado por 0.5 × R0 y 1.5 × R0, el par FRET ECFP-EYFP tiene un rango dinámico de 2.5-7.3 nm debido a su R0 de 4.9 nm4.
El brillo de un fluoróforo viene dado por el producto de su coeficiente de extinción molar y su rendimiento cuántico. Para las mediciones FRET, es ventajoso elegir fluoróforos de brillo casi similar. Esto mejora la detección del enfriamiento del donante y la emisión sensibilizada del aceptor. También favorece la calibración del sistema de microscopía. Al observar los pares FRET de proteínas cian y fluorescentes de uso frecuente, el menor brillo de las proteínas fluorescentes cian se vuelve obvio (Figura 1A).
Sin embargo, la vida útil del aceptor debe ser inferior a la vida útil del donante, lo que garantiza la disponibilidad del aceptor para la transferencia de energía. Si la vida del aceptante excede la vida del donante, el aceptor aún podría estar en el estado excitado cuando el donante se excita nuevamente. Las proteínas fluorescentes cian avanzadas como mTurquoise muestran una vida útil prolongada y, por lo tanto, contribuyen a una mayor probabilidad de FRET (Figura 1B). La probabilidad de FRET también depende del coeficiente de extinción molar del aceptor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Los experimentos de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) basados en emisiones sensibilizadas se realizan fácilmente, pero dependen de la configuración microscópica. Los microscopios de barrido láser confocal se han convertido en un caballo de batalla para los biólogos. Los sistemas comerciales ofrecen una alta flexibilidad en el ajuste de potencia láser y la sensibilidad del detector y, a menudo, combinan diferentes detectores para obtener la imagen perfecta. Sin embargo, la comparación de datos basados en la intensidad de diferentes experimentos y configuraciones a menudo es imposible debido a esta flexibilidad. Los procedimientos amigables para los biólogos son una ventaja y permiten un ajuste simple y confiable de la configuración del láser y el detector. 
Además, como los experimentos FRET en células vivas se ven afectados por la variabilidad en la expresión de proteínas y las relaciones donante-aceptor, los niveles de expresión de proteínas deben considerarse para la evaluación de datos. Aquí se describe un protocolo simple para mediciones FRET confiables y reproducibles, que incluye rutinas para la estimación de la expresión de proteínas y el ajuste de la intensidad del láser y la configuración del detector. La evaluación de los datos se realizará mediante calibración con una fusión de fluoróforos de eficiencia FRET conocida. Para mejorar la simplicidad, se han comparado los factores de corrección que se han obtenido en las células y mediante la medición de proteínas fluorescentes recombinantes.

Ajuste del microscopio de barrido láser confocal El ajuste láser reveló un aumento lineal de la emisión con el aumento de la intensidad del láser (Figura 2 y Tabla 1). Como era de esperar para los láseres de iones de argón, la emisión de la línea de 514 nm fue mucho mayor que la emisión de la línea de 458 nm, como lo demuestra una pendiente más pronunciada. Para experimentos posteriores, se eligió una potencia láser de 4,5% y 6,5% para la l?...

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FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Se proporciona un protocolo para configurar un microscopio de barrido láser confocal estándar para mediciones de transferencia de energía de resonancia Förster in vivo , seguido de una evaluación de datos.

Mediciones de transferencia de energía por resonancia de Förster en células vegetales vivas

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

El protocolo proporciona un procedimiento simple para hacer que los experimentos FRET mediante emisiones sensibilizadas sean más reproducibles y comparables. La principal ventaja de FRET son las mediciones en tiempo real para que se puedan abordar los procesos dinámicos. Para el ajuste con láser utilizando un fotomultiplicador de transmisión, coloque la diapositiva de ocho pocillos que contiene los protoplastos transfectados bajo el microscopio.Después de seleccionar un pozo vacío, elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable. A continuación, aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% mientras graba la señal correspondiente. Para el ajuste láser mediante el modo reflectante, seleccione un pozo vacío y, a continuación, aplique un filtro de reflexión.Active el modo de reflexión y asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser. Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable. A continuación, mueva el objetivo a la posición más baja antes de volver a moverlo hacia arriba hasta que el reflejo de la cubierta sea visible, luego aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% mientras graba la señal correspondiente.Para la evaluación de datos, tabule y ordene los datos por intensidades de señal, luego trace las intensidades de señal contra la potencia relativa del láser y elija las intensidades del láser que resultan en una intensidad de señal similar. Para el ajuste de los fotomultiplicadores, seleccione un pozo vacío y aplique un filtro de reflexión, cambie al modo de reflexión y asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser. Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la ganancia del detector a la mitad del máximo y ajuste la intensidad del láser al ruido de fondo detectable.A continuación, mueva el objetivo a la posición más baja antes de volver a moverlo hacia arriba hasta que el reflejo del deslizamiento sea visible, luego aumente la ganancia del detector en pasos de 50 a 100 voltios y registre la señal correspondiente. Para la evaluación de datos, trace la intensidad contra la ganancia del detector para cada detector, luego elija las ganancias individuales del detector para obtener una sensibilidad similar. Para la adquisición de imágenes, elija los filtros apropiados o espejos dicroicos y use el mismo espejo dicroico para todos los canales para habilitar el escaneo línea por línea, luego seleccione un objetivo de inmersión en agua para la obtención de imágenes de células vivas y elija escaneo de 12 o 16 bits con velocidad de escaneo moderada.A continuación, defina el rango de detección preferiblemente de 470 a 510 nanómetros para la detección de donantes y de 530 a 600 nanómetros para la detección de aceptores en el caso del par FRET de proteína fluorescente cian mejorada o ECFP y proteína fluorescente amarilla mejorada o EYFP. Después de aplicar la configuración del detector y el láser como se demostró anteriormente, revise la intensidad del láser en función de la tabla de potencia láser obtenida si es necesario. Asegúrese de que la relación señal-ruido cubra todo el rango dinámico de los detectores.Después de ajustar el diámetro del agujero de alfiler mientras se mantienen constantes las intensidades del láser y las ganancias del detector, realice las mediciones FRET tomando imágenes de al menos 20 celdas. Para determinar las correcciones de diafonía, realice mediciones FRET con células que expresan solo el fluoróforo del donante y solo con aquellas que expresan el fluoróforo aceptor. Para la calibración de las mediciones, realice mediciones FRET con células que expresen la fusión del aceptor donante.Para la evaluación de datos, obtenga perfiles de línea de las celdas asegurándose de que cada perfil no contenga más de una celda. Guarde los perfiles como archivos de texto. Luego, usando la opción de importación de archivos de texto en la sección de datos, importe los archivos de texto a una hoja de cálculo.A continuación, lea los valores máximos aplicando la función máxima, luego enumere los valores obtenidos en una tabla que tenga una columna cada una para ID de emisión de donante, IF de emisión de FRET, IA de emisión de aceptor y al menos cuatro conjuntos de datos, solo donante, solo aceptor, fusión donante-aceptor y medición. El ajuste láser reveló un aumento lineal en la emisión con el aumento de la intensidad del láser. Como lo demuestra una pendiente más pronunciada, la emisión de la línea de 514 nanómetros fue mucho mayor que la emisión de la línea de 458 nanómetros.Variar las ganancias del detector a una potencia láser constante reveló un comportamiento exponencial para ambos detectores analizados. La discrepancia y el sangrado espectral del donante y el aceptor analizados con proteínas purificadas recombinantes y analizados con células que expresan esas proteínas demuestra que es imposible omitir la determinación del sangrado espectral en células vivas probablemente causado por pigmentos celulares. La eficiencia FRET entre las subunidades ATPA vacuolares marcadas, VHA AECFP y VHA AEYFP disminuyó con el aumento de la intensidad de la señal.Por el contrario, la interacción entre VHA E1 ECFP y VHA CEYFP fue independiente de la intensidad de la señal. La elección de los componentes ópticos adecuados es crucial para la detección del donante y el aceptor. Este protocolo también se puede aplicar para sensores ratiométricos en células vivas para aumentar la reproducibilidad en estos experimentos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

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Investigación

Bioquímica

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The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

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Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

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