Name: f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells
Uploaded: 2021-06-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

Experimenten utfördes vid Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) vid fakulteten för biologi, Bielefeld University. Detta arbete har finansierats av Bielefeld University.

OBS: För följande protokoll utfördes transienta transfection av protoplaster, som beskrivits tidigare12. Nedan ges en kort beskrivning.
1. Övergående transfektion av protoplaster
<ol><li>Skär ~ 4 g friska blad av Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia i 1 mm skivor och överför dem till 20 ml enzymlösning (1,5% cellulas; 0,4% macerozym; 0,1% bovint serumalbumin Fraction V; 0,4 M mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino) etan.</li>
...

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#246;rster+resonance+energy+transfer-+FRET+what+it+is,+why+do+it,+and+how+it's+done.">F&#246;rster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done.</a> Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS ONE. 7, 49593 (2012).</li><li>M&#252;ller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of F&#246;rster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).</li><li>Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+FRET-microscopy+in+living+plant+cells.">GFP-based FRET-microscopy in living plant cells.</a> Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).</li><li>Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).</li><li>Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+C-termini+of+V-ATPase+subunits+by+in+vivo-FRET+measurements.">Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements.</a> FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).</li><li>Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+iso-enzymes+of+plant+V-ATPase+as+revealed+by+in+vivo-FRET.">Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET.</a> BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).</li><li>Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+energization+state+affects+peripheral+stalk+stability+of+plant+vacuolar+H+-ATPase+and+impairs+vacuolar+acidification.">The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification.</a> Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).</li><li>Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+constitutive+and+inducible+promoters+for+the+overexpression+of+transgenes+in+Arabidopsis+thaliana.">Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).</li><li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+and+FRET-analysis+of+subunits+c+and+a+of+the+vacuolar+H+-ATPase+in+living+plant+cells.">Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells.</a> Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).</li><li>Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphatidylinositol-3-kinase-dependent+signal+transition+regulates+ARF1+and+ARF6+during+FC&#947;+receptor-mediated+phagocytosis.">A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FC&#947; receptor-mediated phagocytosis.</a> PLoS Biology. 4, 162 (2006).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16, 277-278 (2019).</li></ol>

Givarsläckning och sensibiliserade acceptor utsläpp kännetecknas av ett linjärt förhållande som möjliggör antingen givaren- eller acceptorbaserad beräkning av FRET. Motsvarande linjäritetsfaktorer kallas antingen G-faktor (givare till acceptor) eller xi (acceptor till donator), som är ömsesidiga värden4. Mätning av FRET mellan fluorescerande proteiner genom fluorescensmikroskopi kräver ofta korrigeringar för DSBT och ASBT på grund av den breda absorptionen och emissionsspektra av ...

Förster resonans energiöverföring ((F)RET) observeras vanligtvis av fluorescensspektroskopi, även om själva processen inte är begränsad till att inträffa mellan fluoroforer. Den underliggande dipol-dipolkopplingen kräver helt enkelt en ljusemitterande donatormolekyl och en ljusabsorberande acceptor. Detta härleds från den erforderliga spektral överlappning integrerad J av normaliserade givaren utsläpp och acceptor absorbans spektra1. Men eftersom RET konkurrerar med fluorescens blir energiöverföringen mätbar genom förändringar i fluorescensutsläpp: RET inducerar givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp.
Fluorofor-baserade RET har kallats fluorescens resonans energiöverföring (FRET) för att skilja den från bioluminescens resonans energiöverföring (BRET). RET beror starkt på avståndet mellan donator och acceptor, som ligger i stor utsträckning i intervallet 0,5-10 nm2 och därmed i samma intervall som dimensionerna av proteiner och deras komplex. För det andra beror RET på dipol-dipolorienterings orientering kappa kvadrat. I kombination med det faktum att rotationsfriheten hos proteinbundna fluoroforer kan försummas på grund av molekylvikten och den långsamma rotationsavslappningen, möjliggör RET analys av konformationsförändringar3.
Den så kallade Försterradien är baserad på den spektralöverlappande integralen och våglängdsområdet för överlappningen, så att röda ljusabsorberande kromoforer resulterar i längre Förster-radier än blå ljusabsorberande färgämnen. Eftersom det dynamiska intervallet för FRET-mätningar begränsas av 0,5 × R0 och 1,5 × R0, har FRET-paret ECFP-EYFP ett dynamiskt omfång på 2,5-7,3 nm på grund av dess R0 på 4,9 nm4.
Ljusstyrkan hos en fluorofor ges av produkten av dess molarutrotningskoefficient och dess kvantutbyte. För FRET-mätningar är det fördelaktigt att välja fluoroforer med nästan liknande ljusstyrka. Detta förbättrar upptäckten av givarsläckning och sensibiliserade acceptorutsläpp. Det gynnar också kalibreringen av mikroskopisystemet. Om man tittar på de ofta använda FRET-paren av cyan- och fluorescerande proteiner blir den lägre ljusstyrkan hos de cyan fluorescerande proteinerna uppenbar (figur 1A).
Acceptorns livstid måste dock vara lägre än givarens livslängd, vilket säkerställer att acceptorn är tillgänglig för energiöverföring. Om acceptorns livstid överskrider donatorns livstid kan acceptorn fortfarande vara i upphetsat tillstånd när donatorn är upphetsad igen. Avancerade cyan fluorescerande proteiner som mTurquoise visar en förlängd livslängd och bidrar därmed till en ökad sannolikhet för FRET (Figur1B). Sannolikheten för FRET beror också på acceptorns molarutrotningskoefficient.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil Immersol&#160; W2010</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>refraction index of water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer measurements in living plant cells

Sensibiliserade emissionsbaserade Fret-experiment (Förster resonance energy transfer) är lätta att göra men beror på den mikroskopiska installationen. Konfokala laserskanningsmikroskop har blivit en arbetshäst för biologer. Kommersiella system erbjuder hög flexibilitet i lasereffektjustering och detektorkänslighet och kombinerar ofta olika detektorer för att få den perfekta bilden. Jämförelsen av intensitetsbaserade data från olika experiment och inställningar är dock ofta omöjlig på grund av denna flexibilitet. Biologvänliga procedurer är till fördel och möjliggör enkel och tillförlitlig justering av laser- och detektorinställningar. 
Eftersom FRET-experiment i levande celler påverkas av variabiliteten i proteinuttryck och donator-acceptor-förhållanden, måste dessutom proteinuttrycksnivåer beaktas för datautvärdering. Beskrivs här är ett enkelt protokoll för tillförlitliga och reproducerbara FRET-mätningar, inklusive rutiner för uppskattning av proteinuttryck och justering av laserintensitet och detektorinställningar. Datautvärderingen kommer att utföras genom kalibrering med en fluoroforfusion av känd FRET-effektivitet. För att förbättra enkelheten har korrigeringsfaktorer jämförts som har erhållits i celler och genom att mäta rekombinanta fluorescerande proteiner.

Justering av det konfokala laserskanningsmikroskopet Laserjusteringen visade en linjär ökning av utsläppen med ökande laserintensitet (figur 2 och tabell 1). Som förväntat för argonjonlasrar var utsläppen av 514 nm-linjen mycket högre än utsläppen av 458 nm-linjen, vilket framgår av en brantare sluttning. För efterföljande experiment valdes lasereffekt på 4,5% respektive 6,5% för 514 nm-linjen respektive 458 nm-linjen. Detta resulterade i ...

Watch this Scientific Journal Video about FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells at JoVE.com

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Ett protokoll tillhandahålls för att ställa in ett standardkonokalt laserskanningsmikroskop för in vivo Förster resonansenergiöverföringsmätningar, följt av datautvärdering.

Förster Resonance Energy Transfer Mätningar i levande växtceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Protokollet ger ett enkelt förfarande för att göra FRET-experiment genom sensibiliserade utsläpp mer reproducerbara och jämförbara. Den största fördelen med FRET är mätningar i realtid så att dynamiska processer kan hanteras. För laserjustering med hjälp av en transmissionsfotomultreradplier, placera den åtta välrea glid som innehåller de transfekterade protoplasterna under mikroskopet.När du har valt en tom brunn väljer du linjeskanningsläge och histogramvy, minskar laserintensiteten till ett minimum och justerar detektorvinsten till detekterbart bakgrundsljud. Öka sedan laserintensiteten i steg på 0,5%samtidigt som du registrerar motsvarande signal. För laserjustering med reflekterande läge väljer du en tom brunn och applicerar sedan ett reflektionsfilter.Slå på reflektionsläget och se till att detektorvåglängdsområdet täcker laserns våglängd. Välj linjeskanningsläge och histogramvy, minska laserintensiteten till ett minimum och justera detektorns förstärkning till detekterbart bakgrundsljud. Flytta sedan målet till lägsta läge innan du flyttar det tillbaka upp tills reflektionen av täckslipet är synligt och ökar sedan laserintensiteten i steg på 0,5%samtidigt som motsvarande signal registreras.För datautvärdering, tabulera och sortera data efter signalintensiteter, plotta sedan signalintensiteterna mot den relativa lasereffekten och välj de laserintensiteter som resulterar i en liknande signalintensitet. För justering av fotomultipliers, välj en tom brunn och applicera ett reflektionsfilter, byt till reflektionsläge och se till att detektorvåglängdsområdet täcker laserns våglängd. Välj linjeskanningsläge och histogramvy, minska detektorvinsten till hälften av maxvärdet och justera laserintensiteten till detekterbart bakgrundsljud.Flytta sedan målet till lägsta läge innan du flyttar det tillbaka tills reflektionen av täcket är synligt, öka sedan detektorvinsten i 50 till 100 voltssteg och registrera motsvarande signal. För datautvärdering, plotta intensiteten mot detektorns förstärkning för varje detektor och välj sedan de enskilda detektorvinsterna för att få liknande känslighet. För bildförvärv väljer du lämpliga filter eller dichroiska speglar och använder samma dichroiska spegel för alla kanaler för att aktivera linje för radskanning, välj sedan ett vattensänkningsmål för avbildning av levande celler och välj 12 eller 16-bitars skanning med måttlig skanningshastighet.Definiera sedan detektionsområdet helst 470 till 510 nanometer för donatordetektering och 530 till 600 nanometer för acceptordetektering när det gäller FRET-paret av förbättrat cyan fluorescerande protein eller ECFP och förbättrat gult fluorescerande protein eller EYFP. Efter att ha tillämpat detektor- och laserinställningarna som visats tidigare, revidera laserintensiteten baserat på det erhållna lasereffektbordet om det behövs. Se till att signal-till-brus-förhållandet täcker detektorernas hela dynamiska omfång.Efter finjustering med pinhole diameter samtidigt som laserintensiteterna och detektorn ökar konstant, utför FRET-mätningarna och tar bilder av minst 20 celler. För att bestämma crosstalk korrigeringar, utför FRET mätningar med celler som uttrycker givaren fluorophore endast och de som uttrycker acceptor fluorophore endast. För kalibrering av mätningarna, utför FRET-mätningar med celler som uttrycker donator acceptor fusion.För datautvärdering hämtar du radprofiler för cellerna som säkerställer att varje profil inte innehåller mer än en cell. Spara profilerna som textfiler. Importera sedan textfilerna till ett kalkylblad med hjälp av importalternativet för textfiler i dataavsnittet.Läs sedan upp maximivärdena genom att använda maxfunktionen och lista sedan de erhållna värdena i en tabell med en kolumn var för givarutsläpps-ID, FRET-utsläpp IF, acceptera utsläpps-IA och minst fyra datamängder, endast givare, endast accepter, fusion för givare och mätning. Laserjusteringen visade en linjär ökning av utsläppen med ökande laserintensitet. Som framgår av en brantare sluttning var utsläppen av 514 nanometerslinjen mycket högre än utsläppen från 458 nanometerslinjen.Att variera detektorvinsterna med konstant lasereffekt visade ett exponentiellt beteende för båda analyserade detektorer. Diskrepansen och spektralblödningen av givaren och acceptorn analyseras med rekombinanta renade proteiner och som analyseras med celler som uttrycker dessa proteiner visar att det är omöjligt att utelämna bestämning av spektralblödning i levande celler som sannolikt orsakas av cellulära pigment. FRET-effektiviteten mellan de märkta vacuolar ATPA-underenheterna, VHA AECFP och VHA AEYFP minskade med ökande signalintensitet.Däremot var samspelet mellan VHA E1 ECFP och VHA CEYFP oberoende av signalintensiteten. Valet av lämpliga optiska komponenter är avgörande för detektion av givaren och acceptorn. Detta protokoll kan också tillämpas för ratiometriska sensorer i levande celler för att öka reproducerbarheten i dessa experiment.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Fosfoproteomisk strategi för profilering av osmotisk stresssignalering i Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baserad fragmentscreening i ett minimalt prov men maximalt automatiseringsläge

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...