Name: construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings at JoVE.com

ברצוננו להודות לגרג גויטצ'ואנטס על הדרכה עם תכנון ובנייה אלקטרודה וטים גרדנר על פתיחת המעבדה והמתקנים שלו אלינו. ברצוננו להודות לכריסטוס מיצ'אס על עזרתו בשימוש ב-PDS במתקן הליבה של הביו-ממשק והטכנולוגיה ולניל ריטר, ג'ון ספירייס ודיוויד לנדסמן על עזרתם בעיצוב גרסאות מוקדמות של הג'יג בן 16 הערוצים. ברצוננו להודות לטים קאוואנו על עזרתו בהדמיית SEM במרכז למערכות ננומטריות של הרווארד בהרווארד.

<ol>
	<li>Galvani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , (1791).</li><li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+correspondence+of+electrical+and+optical+physiology+in+in+vivo+population-scale+two-photon+calcium+imaging.">On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging.</a> bioRxiv. , 800102 (2019).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+MEMS+and+microsystem+tools+for+brain+research.">State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research.</a> Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).</li><li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Hong, G., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+electrode+technologies+for+neural+recordings.">Novel electrode technologies for neural recordings.</a> Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).</li><li>Chung, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density,+long-lasting,+and+multi-region+electrophysiological+recordings+using+polymer+electrode+arrays.">High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays.</a> Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).</li><li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity.">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li><li>Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+responses+to+neural+implants+impact+signal+sensitivity+and+intervention+strategies.">Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).</li><li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes.">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li><li>Kozai, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).</li><li>Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+recording+and+modulation+technologies.">Neural recording and modulation technologies.</a> Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).</li><li>Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+interfaces+for+intracortical+recording:+requirements,+fabrication+methods,+and+characteristics.">Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).</li><li>Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+finite-element+model+of+the+mechanical+effects+of+implantable+microelectrodes+in+the+cerebral+cortex.">A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex.</a> Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+optogenetics+with+multifunctional+flexible+polymer+fibers.">One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers.</a> Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+composite+with+carbon+nanofibers+aligned+during+thermal+drawing+as+a+microelectrode+for+chronic+neural+interfaces.">Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces.</a> ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).</li><li>Armstrong-James, M., Millar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+fibre+microelectrodes.">Carbon fibre microelectrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 1 (3), 279-287 (1979).</li><li>Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux+of+dopamine+from+the+synaptic+cleft+in+the+nucleus+accumbens+of+the+rat+brain.">Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain.</a> Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).</li><li>Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon-fiber+electrode+array+for+long-term+neural+recording.">A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording.</a> Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).</li><li>Guitchounts, G., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=64-channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+chronic+electrophysiology.">64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).</li><li>Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+dynamics+are+homeostatically+tuned+to+criticality+in+vivo.">Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo.</a> Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).</li><li>Popovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cross-orientation+suppression+and+size+tuning+and+the+role+of+experience.">Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience.</a> Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).</li><li>Patel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+stability+assessment+of+carbon+fiber+microelectrode+arrays.">Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays.</a> Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).</li><li>Welle, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-small+carbon+fiber+electrode+recording+site+optimization+and+improved+in+vivo+chronic+recording+yield.">Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).</li><li>Patel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+linear+8.4+&#181;m+diameter+16+channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+single+unit+recordings.">Insertion of linear 8.4 &#181;m diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings.</a> Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).</li><li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives.">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li><li>Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-plated+electrode+with+high+scratch+strength+for+electrophysiological+recordings.">Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).</li><li>Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-machine+interfaces:+From+basic+science+to+neuroprostheses+and+neurorehabilitation.">Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים כספיים.

פרוטוקול זה מתאר כל שלב הדרוש לבניית CFEA פונקציונלי לשימוש חריף וכרוני כאחד. התהליך המתואר ניתן להתאמה אישית לצרכי החוקר, מה שהופך אותו לאפשרות נגישה וזולה לניטור נוירונים בודדים במשך חודשים. הפרוטוקול מדגים את ההיתכנות של הקלטת פעילות חזקה ביחידה אחת בתוך דקות של השתלה בחיה מרדים, ועל פני ארבעה חודשים בחיה ערה ומתנהגת, הממחישה את הפוטנציאל של CFEAs אלה לחקור שינויים קצרי טווח וארוכי טווח בתגובות עצביות.
שלבי הפרוטוקול המתואר נבדקו ביסודיות ושופרו לאורך זמן כדי להניב הליך יעיל שניתן להשלים במהירות, בעלות שולית נמוכה (< 100.00 דולר), עם יכולת הקלטה של יחידות בודדות חד משמעיות, בצפיפות וביציבות במשך חודשים. ניתן להשלים את שלבי הבנייה בתוך פחות מיום אחד ולייצר אותות אלקטרופיזיולוגיים הדומים לכל מערך מסחרי מוביל. ל- CFEAs יש גם טביעת רגל קטנה בהרבה (חבילת סיבים בת 16 ערוצים בקוטר של ~ 26 מיקרומטר) מאשר מערכים מסחריים דומים, והתאימות הביולוגית שלהם הופכת אותם למתאים לשימוש ארוך טווח13. חשוב לציין, ישנם מספר שלבים קריטיים והוראות שיש לבצע על מנת לייצר CFEA מתפקד עם ביצועים דומים.
בשל שבריריותם של סיבי הפחמן, יש לטפל בהם בזהירות מירבית. טיפול בהם עם מלקחיים חדים או כלים אחרים עלול לגרום לשבר של הסיבים. בנוסף, חשוב לבנות את ה- CFEAs בחלל עם תנועה אווירית מוגבלת, כך שהסיבים לא יתפוצצו. כאשר בוער החלק האחורי של הסיבים, המצית רק צריך להיות מועבר בתנועה הלוך ושוב בקצרה רבה, עבור כ 1 s. השלבים הבאים לאחר הסרה זו של בידוד הם קריטיים לבניית אלקטרודה עם ערוצי עבודה. יש להאכיל את הטיפים הלהבים לתוך הג'יג ללא כל מגע נוסף. לאחר מכן, בעת מילוי האגן במלט דנטלי, חשוב כי המלט מוחל בקפידה וממלא לחלוטין את הערוצים ואת אגן משפך, סגירת הפתחים מבלי למלא אותם. לאחר מכן יש לרפא לחלוטין את המלט הדנטלי עם אור UV לפני שתמשיך. ברגע שזה הושלם, צבע כסף צריך להיות מוזרק לתוך כל ערוץ עד מלא לחלוטין אבל לא נשפך החוצה. זהו השלב המשתנה ביותר בתהליך. כל מילוי יתר יכול לייצר שיחה צולבת בין הערוצים, ומילוי לא מספיק עלול לגרום לכשל בחיבור. אם לא ניתן להזריק צבע כסף באמצעות מחט 25 G, סביר להניח כי הפתרון הוא צמיג מדי, ובמקרה זה, כמות קטנה של מדלל צבע ניתן להוסיף כדי ליצור פתרון נוזלי יותר. לאחר כל הערוצים מלאים, ואת מחבר headstage מוכנס, חשוב לאפשר את המערך לרפא עבור 24 שעות לפני אבטחת המחבר עם מלט שיניים. גילינו שכישלון לעשות זאת הוריד את מספר הערוצים המחוברים. החלת כמות נדיבה של מלט דנטלי חשובה גם כך המחבר לא להתנתק בעת מתמשוק עם מערכת רכישת אותות. אם הם מתנתקים, ניתן לנסות להתחבר מחדש עם מילוי חוזר ונשנה של ערוצים עם צבע כסף, אבל המשתמש צריך לבדוק את ערכי העכבה של CFEA כדי להעריך את מספר הערוצים המחוברים. מתן אפשרות למלט הדנטלי לרפא בן לילה משמש גם למניעת ניתוק פוטנציאלי.
מדידת העכבה של האלקטרודה תספק הערכה מדויקת של ערוצים מחוברים. זה יכול להיעשות לאחר שקוע בחוטי הקרקע והייחוס ואת קצות סיבי הפחמן PBS. ראינו כי עקיפה גבוהה (>15 MΩ) מעידה על ערוץ פתוח, לא מחובר. לפני הזרקת זרם electroplating, ערוץ מחובר יכול להיות מגוון של ערכי עכום זה צריך להקטין באופן משמעותי עם תהליך זה. המספר הממוצע של ערוצים מחוברים (עריסה < 4 MΩ לאחר הזרקה נוכחית) לכל אלקטרודה 16 ערוצים היה 12.96 ± 2.74 (ממוצע ± SD; N = 48 אלקטרודות). מספר פעמים אלקטרו-תול בבדיקה, ו-30 s יצרו בידוד אותות מעולה בין אתרי ההקלטה(איור 5). אמנם נקבע היטב כי PEDOT-pTS12,24,25,26 ו PEDOT-TFB21 לספק אפשרויות אמינות להכנת אתרי הקלטה סיבי פחמן, מצאנו כי ציפוי עם זהב, שיטה מוכחת ומהימנה עבור electroplating אלקטרודות עבור השתלה כרונית27,28 הגדיל את קלות ההשתלה ומנע מהקצוות האלקטרודה להתעשת יחד., בהפקת ערכי עכבה סופיים של פחות מ- 0.2 MΩ בממוצע, שיטה זו מוכיחה השוואה לערכים שהושגו באמצעות PEDOT-TFB21 ו- PEDOT-pTS26.
בעת השתלת מערך microelectrode, חשוב לעקוב חזותית אחר החדרת קצות סיבי הפחמן מתחת למיקרוסקופ. החדרה מוצלחת צריכה להיות גלויה, ללא כיפוף של הסיבים. אם הסיבים נראים קורסים, לא סביר שהם ייכנסו בהצלחה למוח. במקרה זה, יש להתאים את זווית הגשוש לניסיון שני. תהליך זה יכול להימשך עד שהכנסת הבדיקה תצליח. ברגע שהאלקטרודה נמצאת בעומק הרצוי, גילינו שהמתנה של לפחות 30 דקות תאפשר לגשוש להסתפק ברכישת אותות אופטימלית (הקלטות חריפות).
ה- CFEAs המתוארים, בנוסף לטביעת הרגל הקטנה שלהם וההתאמה הביולוגית שלהם, מציעים חלופה חזקה הניתנת להתאמה אישית למערכים מסחריים בשל קלות הבנייה והעלות הנמוכה שלהם. המגבלה הגדולה ביותר ל- CFEAs המפורטת בפרוטוקול זה היא המדרגיות שלהם. בשל האופי הידני של בנייתם, קנה המידה עד עיצובים עם מאות אתרי הקלטה לא יכול להיות מעשי. בנוסף, התקדמות בייצור מערך מיקרו-ectrode באמצעות ננוטכנולוגיה תאפשר הקלטות אוכלוסין בקנה מידה גדול יותר מהשיטות המתוארות כאן. עם זאת, פרוטוקול זה מספק נגישות CFEA למעבדות המעוניינות בייצור benchtop של אלקטרודות סיבי פחמן. לא ראינו אובדן יציבות או ירידה בחוסן במשרעת ספייק לאורך 120 יום הניסויים הכרוניים, כפי שצוין על ידי ערוץ יחיד מייצג האופייני לתצפיות שלנו בסולם הזמן הזה (איור 6A-E). בנוסף, ה- CFEAs מציגים את היכולת לפעילות מתמדת של יחידה אחת, שכן ארבע יחידות בודדות נותרו מובחנות 11 חודשים לאחר ההשתלה בעכבר (איור 6G, H). ניתן גם להשיג הקלטות יציבות של יחידה אחת באופן חריף(איור 7),המציע יתרון על פני אלקטרודות מסחריות רבות אחרות לחקר נוירונים בודדים על פני פרקי זמן קצרים. בעתיד, פיתוח של בדיקות גמישות וגמישות כאלה עם קטרים מינימליים יאפשר חקר תהליכים מורכבים. כלים אלה יספקו תועלת משמעותית בקידום הטכנולוגיה העצבית, כולל יישומים בממשקי מוח-מכונה (BMIs), הדורשים יציבות רציפה וארוכת טווח29.

אלקטרודות ומערכי אלקטרודה הם כלים בעלי ערך להבנת האופן שבו המוח מעבד מידע ברמה העצבית. בעוד הקלטות אלקטרופיזיולוגיות היו בר השגה במשך יותר ממאתיים שנה,עדיין לא ניתן למדוד בו זמנית את הפעילות של מעגלים עצביים שלמים ברזולוציה המרחבית והזמן הנדרשת כדי ללכוד את spiking של נוירונים בודדים. למרות שיטות לא פולשניות, כגון אלקטרואנצפלוגרפיה2, טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים3, והדמיה תהודה מגנטית תפקודית4 מאפשרים מדידות מוח שלם, הם לא יכולים להשיג את הרזולוציה המרחבית והזמן הדרושה לפתרון הפעילות של מעגלים עצביים2,5. לעומת זאת, שיטות הדמיה כגון הדמיה אופטית באמצעות צבעים רגישים למתח או אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית יכול להשיג רזולוציה מרחבית יחידה אחת, אבל הם מציבים בעיות כגון רזולוציה זמנית נמוכה סלקטיביות ירודה3,4,5,6. הקלטות חשמליות הן חלופה רבת עוצמה לשיטות אלה. הקלטה אלקטרודות לספק רזולוציה זמנית שאין דומה לה ולאפשר למשתמש לבצע מדידות עם דיוק ספייק-זמן בכל אזור של המוח7. בנוסף, מערכים רב-אלקטרוניים מושתלים כרונית (MEAs) מאפשרים בקנה מידה גדול(עשרותעד מאות תאים), הקלטות של תאים בודדים בבעלי חיים מתנהגים על פני תקופה של ימים עד חודשים 8,9. עם זאת, בדיקות סיליקון המתעדות בצפיפות גבוהה יותר יש טביעת רגל גדולה והם פולשניים מאוד, מערכים מושתלים כרונית לעתים קרובות ליצור תגובה דלקתית, אנקפסולציה רקמות, ומוות עצבי10,11,12,13.
המגבלות של אלקטרודות קיימות הביאו לחידושים אחרונים המאפשרים הקלטות יציבות, ברזולוציה גבוהה, לטווח ארוך. אלקטרודות טיפוסיות מורכבות ממוליך מתכתי, כגון טונגסטן או פלטינה-אירידיום, או מבוססות סיליקון או פולימר. בעוד מערכי מיקרו-חוט מבוססי מתכת יכולים לשמור על הקלטות ארוכות טווח ויציבות, יש להם טביעת רגל גדולה בהרבה, עם קוטר חוט יחיד הנע בין 10-200 מיקרומטר14. לעומת זאת, מערכי אלקטרודה מבוססי סיליקון מניבים הקלטות ברזולוציה מרחבית גבוהה, אך בשל העיצוב הנוקשה יחסית שלהם, הם בדרך כלל אינם מסוגלים לשמור על האות וההקלטה מאותם נוירונים במשך חודשים רבים15. ההתפתחויות האחרונות במערכים מבוססי סיליקון הביאו אלקטרודות שיכולות לבצע הקלטות כרוניות באופן אמין, אך לא ניתן להשתמש במערכים אלה כדי להקליט מאזורי מוח עמוקים בבעלי חיים גדולים יותר ומיועדים להקלטות ליניאריות9. ההתקדמות במערכי הפולימר הביאה לגמישות מוגברת וליציבות רישום של יחידות בודדות ומציעות פוטנציאל להקלטות בצפיפות גבוהה בעתיד הקרוב, אך עם זמינות מוגבלת כרגע8,16,17. סיבי פחמן מאפשרים הקלטות בצפיפות גבוהה עם חומרים מדף המתוארים כאן.
מיקרואלקטרודים להקלטת סיבי פחמן שימשו במשך עשרות שנים, כאשר האלקטרודות הראשונות של סיבי פחמן המורכבות מסיבי פחמן יחיד מוכנסים למיקרופיט זכוכית. מיקרו-קטרודות אלה שימשו להקלטות חוץ-תאיות ליחידה אחת, ולמרות שיחס האות לרעש היה דומה למיקרו-קטרודות הטונגסטן בזכוכית הטובות ביותר, הן היו מועילות בשל גמישותן, ערכי עבלות נמוכים יותר ופשטות לייצור18,19. המאמצים לפתח מערכי אלקטרודה סיבי פחמן הואצו לאחרונה בשל יכולות biosensing של סיבי פחמן. בנוסף ליכולת הביולוגית המוגברת שלהם ומוליכות חשמלית יוצאת דופן, הם כוללים קבוצה ייחודית של מאפיינים, כולל התנגדות בטמפרטורה גבוהה, צפיפות יחסית נמוכה, חוזק מתיחה גבוה, נוקשות כיפוף נמוכה, רגישות לזיהוי גבוהה, ואזור חתך קטן10,12. כל המאפיינים הללו הניבו את הפיתוח של מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן (CFEAs) המאפשרים הקלטות כרוניות, יציבות, בעלות תפוקה גבוהה של נוירונים בודדים. כעת ניתן ליצור CFEAs כאלה ביד20,21 ( איור1), מערכי מיקרו-ectrode מניבים שיכולים להכיל נוירונים בודדים במשך חודשים. מתואר כאן תהליך בנייה נגיש עבור CFEAs שהותאם בשתי דרכים להקלטות חריפות וכרוניות של נוירונים בודדים בשני מינים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-15</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel CFEA Jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79014-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-84</td>
			<td>Building tool - sharp-tipped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-03</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing</td>
			<td>Small Parts Inc</td>
			<td>B000FMYN38</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel CFEA jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79022-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 in cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-156</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCad 3D printing software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD disposable syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fibers</td>
			<td>Good Fellow USA</td>
			<td>C 005725</td>
			<td>7 &#956;m epoxy sized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes and cassette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For coating fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowable Dental Composite</td>
			<td>Pentron</td>
			<td>Flow-It ALC</td>
			<td>CFMA component/ UV cured dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold plating solution</td>
			<td>Sifco ASC</td>
			<td>5355</td>
			<td>10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0&#8211;5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewelry clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00GRABH9K</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRClust</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ferret spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>BIC</td>
			<td>LCP62DC</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PS-7000C</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-953-1B</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MountainSort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mouse spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 16-channel adapter</td>
			<td>Multi-channel systems</td>
			<td>ADPT-nanoZ-NN-16</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 32-channel adapter</td>
			<td>White Matter</td>
			<td>NZA-OMN-32 rev A</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ multi-electrode impedance tester</td>
			<td>White Matter</td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Stockroom</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Semi-transparent, flexible film with adhesive properties</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parylene &#39;C&#39; Dimer</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>980130-C-01LBE</td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide tubing</td>
			<td>MicroLumen</td>
			<td>BRAUNI001</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>300124</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver conductive coating</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>842AR Super Shield</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with range 6.7:1</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky notes</td>
			<td>Post-it</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue wipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797550</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing wand</td>
			<td>Woodpecker</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum deposition chamber</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td></td>
			<td>Labcoter 2 (PDS 2010)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings

מערכי אלקטרודה רב-ערוציים מציעים תובנה על המוח העובד ומשמשים להבהרת תהליכים עצביים ברמות התא והמעגל הבודד. פיתוח כלים אלה חיוני להבנת התנהגויות וקוגניציה מורכבות וקידום יישומים קליניים. עם זאת, זה עדיין אתגר לתעד בצפיפות מאוכלוסיות התאים ביציבות וברצף לאורך תקופות זמן ארוכות. אלקטרודות פופולריות רבות, כגון tetrodes ומערכי סיליקון, כוללות קטרים צולבים גדולים המייצרים נזק עם החדרה ומעוררים תגובות רקמות תגובתיות כרוניות הקשורות למוות עצבי, המעכבות את ההקלטה של פעילות עצבית יציבה ורציפה. בנוסף, רוב חבילות החוטים מציגות מרווח רחב בין הערוצים, המונע הקלטה סימולטני ממספר רב של תאים המקובצים באזור קטן. מערכי המיקרו-ectרודe של סיבי הפחמן המתוארים בפרוטוקול זה מציעים פתרון נגיש לחששות אלה. המחקר מספק שיטה מפורטת לייצור מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן שניתן להשתמש בהם להקלטות חריפות וכרוניות ב- vivo. המאפיינים הפיזיים של אלקטרודות אלה הופכים אותם לאידיאליים להקלטות יציבות ומתמשכות לטווח ארוך בצפיפות תאים גבוהה, ומאפשרים לחוקר לבצע הקלטות חזקות וחד משמעיות מיחידות בודדות לאורך חודשים.

עם השלמת פרוטוקול זה, הקלטות יציבות של פעילות ספייק יחידה אחת יהיו אפשריות. מערכי מיקרו-ectrode אלה ניתנים להתאמה אישית בחומרים, בספירת ערוצים ובמתאם הבמה על בסיס צרכי החוקר. אלקטרו-תזרים סיבים בזהב גורם לירידה בעקיפה המתאימה להקלטה (איור 4 ואיור 5). אם המשתמש מתכוון להקליט באופן כרוני, מדידות ניתן לבצע לאחר החיה התאוששה מההליך הכירורגי. הליכים כרוניים הביאו להקלטות יציבות של יחידה אחת במשך 120 יום לפחות. הקלטה מייצגת מוצגת באיור 6, הממחישה פעילות אלקטרופיזיולוגית יציבה בת 64 ערוצים בקליפת המוח הרטרספלנית של עכבר גברי בוגר שמתנהג בחופשיות. אם נדרשת הכנה חריפה, ההקלטות יכולות להתחיל זמן קצר לאחר ההשתלה (כ-30 דקות). זה יאפשר זמן לאלקטרודה להתיישב במוח. איור 7 מספק דוגמה מייצגת להקלטת CFEA חריפה בת 16 ערוצים שנרכשה מקליפת המוח החזותית העיקרית של חמוס נקבה בוגרת. מיון ספייק בעכבר וחמוס בוצע עם תוכנת מיון ספייק (ראה טבלת חומרים).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg"> איור 1: אנטומיה של מערכי מיקרו-פחמן (CFEAs) בעלי 16 ו-32 ערוצים. (A) שרטוטים של CFEA בעלי 32 ערוצים (למעלה) ו-16 ערוצים (למטה) משלוש תצוגות שונות. CFEA בן 16 הערוצים כולל עיצוב מורחב למטרות טיפול. העיצוב בן 32 הערוצים כולל פנים שטוחות המאפשרות שילוב של שני פאזלים עבור CFEA בן 64 ערוצים. לשתי הדיאגרמות יש מבנים מזהים המסומנים בממדים. קצה המחבר מציין את המיקום של הוספת המחבר, וערוצי GND/REF מציינים היכן נוסף חוט האריקה. אגן המשפך מתייחס למיקום שבו הסיבים עוברים כדי להיות overlaid עם מלט שיניים UV נרפא אור, ואת קצה משפך מסמל את האתר שממנו הסיבים לצאת את הג'יג. קצה המשפך מחולק לרבעים כדי למזער סיבים הנצמדים זה לזה ויוצרים נזק. הסיבים נמשכים מאוחר יותר לתוך חבילה אחת עם השימוש במלט השיניים. Jigs מודפסים בתלת-ממד באמצעות מדפסות שרף SLA. דיאגרמות מוגדלות כדי להציג פרטים. (B)CFEA בנוי. לדיאגרמה יש מבנים מזהים המסומנים בתווית. קצה החבילה הכחולה מייצג את פלח סיבי הפחמן הנוכשים מדידות הקלטה. האפור בתוך אגן המשפך וסביב המחבר מעיד על מלט דנטלי שנרפא באור UV המחזיק סיבי פחמן במקומו באגן המשפך ומאבטח את המחבר לג'יג. החוט הסגול מייצג את חוט ההארקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg"> איור 2: העמסת סיבי פחמן גולמיים לקלטות לציפוי פארילן C. (A)סיבי פחמן נטענים על מחסניות עם שתי רצועות של סרט דו-צדדי (כחול). כל קלטת עמוסה בסיבים ~ 25. (B)קלטות נטענות למחזיק חיתוך בלייזר (אפור) כהכנה לציפוי פארילן C. כל אחת מהן מכילה עשר קלטות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg"> איור 3: מערך מיקרו-פחמן מיקרו-קטרודות (CFEA) סכמטי בניית חבילות. (A)16 סיבי פחמן מצופים בודדים (שחור) משורשרים דרך הג'יג המודפס בתלת-ממד (אפור) בן 32 ערוצים. (B)קצות סיבי פחמן נחתכים עם מיקרו מספריים, משאיר סיבים עודפים שווים לגובה של בסיס ג'יג, המשתרעים מתוך בסיס הג'יג. (C)מצית גלגל ניצוץ פלסטיק סטנדרטי מועבר במהירות מעל הסיבים העודפים כדי להסיר בידוד פארילן C. השרטוט הימני העליון מראה את הסרת פארילן מ 9 מתוך 12 סיבים. סיבים (D)הם reinserted לתוך הג'יג עד סוף הסיבים הוא לשטוף עם הבסיס. השרטוט הימני העליון מציג את ההקדמה של 9 סיבים עם טיפים סיבים לא מבודדים (אפורים) השוכנים בתוך בסיס הג'יג. לאחר מכן, הג'יג מתהפך ושלבי A-D חוזרים על עצמם כדי להשחיל את 16 הערוצים ההפוכים. (ה)הג'יג מלא במלט דנטלי כדי לאבטח את הסיבים. הדפס כסף מוזרק לכל באר של בסיס הג'יג. (F)המחבר הגברי מוכנס לבסיס הג'יג. (G)CFEA ואזמל קפואים במקפיא -20 מעלות צלזיוס. קצה המערך נחתך לאורך הרצוי, ומשאיר 32 סיבים זוגיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg"> איור 4: טיפול טיפים ואלקטרו-צילומי. (A)טיפים אלקטרודה ממוקמים לראשונה ב- 0.1 M PBS, שם הזרם מועבר דרך כל אלקטרודה. הטיפים נשטפים ומועברים לתמיסת ציפוי זהב, שם הם אלקטרופלסטיים עם הזרם. (B)תמונות SEM של סיבי פחמן מוכנים מראות תמיסה ציפוי זהב מרוכז בקצה. סרגל קנה המידה מייצג 4 מיקרומטר. (C) ערכי עקיפה מ- 168 ערוצים לאחר חיתוך ראשוני (סגול; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ, חציון ± SE, n = 168 סיבים), הזרקה נוכחית חיובית (ורוד; 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ, חציון ± SE, n = 168 סיבים) ואלקטרו-פלסטיק (כתום; 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ, חציון ± SE, n = 168 סיבים) מראים ערכי עפגמה מופחתים לאחר כל שלב עיבוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg"> איור 5: משכי זמן מתונים של אלקטרופלינט זהב מייצרים מרבצים קטנים ומעוגלים על טיפים לחבילת סיבי פחמן. טיפים סיבי פחמן בתמונה הם כולם מערכי microelectrode שונים, המשקף משכי זמן שונים של זרם מוזרק להפחתת עכום או ציפוי זהב. תמונות מתארות בנוסף את ציפוי פארילן C, המבודד את סיבי הפחמן ומונע כל רכישה של אות ממיקום שאינו קצות הסיבים. (A)סריקת תמונת מיקרוסקופיה אלקטרונית של קצות סיבי פחמן לאחר הקפאה וחיתוך יחיד עם סכין גילוח. מוטות קנה מידה מייצגים 10 מיקרומטר. (B)זהה ל- A אך לאחר מכן עם הזרקת זרם חיובי עבור10 s. (C) זהה ל- B, אך לאחר מכן אלקטרופל עם זהב עבור 120 s. (E) זהה ל- B, אך לאחר מכן התחשמל בזהב למשך 30 s. (F) זהה ל- B אך לאחר מכן אלקטרופל עם זהב במשך 120 s. מצאנו כי electroplating עבור 30 s בזרם של -0.05 μA היה אופטימלי עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg"> איור 6: הקלטות חוץ־תאיות כרוניות בקליפת המוח הרטרספלנית של העכבר המתנהגת בחופשיות עם מערכי מיקרו-נקטרודה מסיבי פחמן מראות פעילות עצבית מתמשכת ויציבה. (A)11 עקבות מתח שעברו רצועת הלהקה נרשמו בו זמנית. מעקבים הבאים שנרשמו מהעוץ הראשון (השורה העליונה) משורטטים ב- B כדי להציג עמידות לאורך זמן. עשר השורות הנותרות ממחישות את העקביות של איכות ההקלטה ומציגות פעילות חזקה במערך. סרגל קנה מידה משמאל לכל מעקב מייצג פוטנציאל של 200 μV. (B)Bandpassed נתונים מאותם סיבים כמו במעקב העליון ב- A, התרחב כדי להציג פעילות חזקה על פני הקלטה רציפה של 120 יום. (C)קיבוץ באשכולות חושף זיהוי חזק של יחידה אחת במשך חודשים. עקבות מייצגות את צורת הגל הממוצעת של יחידה יחידה ייצוגית הנצפית ברציפות לאורך 120 יום, המופקת מהסיבים המתוכננים ב- B בכל נקודת זמן. (D)ממוצע, צורות גל ספייק לא מנורמלות מ- C נערמו כדי להפגין עקביות לאורך זמן. (ה)הקלטות סיבי פחמן מראות רצפת רעש יציבה במשך חודשים רבים. סטיית התקן של רצפת הרעש (מעקב פחות פעילות ספייק) ב- B אינה מראה שינוי הדרגתי ברעש. ברים מייצגים זיהום ממוצע. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. (ו)ציור קנה מידה של עכבר עם CFEA מושתל כרונית והבמה. (G)מעקב מתח גולמי (למעלה) 11 חודשים לאחר ההשתלה מראה LFP חזק. מעקב מתח פסים (למטה) מראה פעילות עצבית יציבה. (H)צורת גל ספייק ממוצעת של הנוירון שנרשמה על הסיבים מ- C, underlaied על ידי 1,000 המקרים הראשונים של פעילות spiking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg"> איור 7: הקלטות מערך מיקרו-פחמן (CFEA) מקליטה ראשונית של קליפת המוח החזותית העיקרית של החמוס. (A)צורות גל של ספייק ממוינות יחידות בודדות שנרשמו מ- CFEA בן 16 ערוצים. פוטנציאל פעולה של נוירונים בודדים ניכרו לעתים קרובות בערוצים מרובים בשרעת מעט שונה. (B)עקומות כוונון כיוון מתאי עצב נבחרים. צבעים תואמים ליחידות מוקלטות ב- A. החצים מצביעים על כיוון תנועת הגירוי. סרגלי קנה מידה מציינים את קצב התגובה. קווי שגיאה מציינים את התגובה הממוצעת עם שגיאה סטנדרטית. הקו המקווקו האופקי מייצג את קצב הירי הספונטני של אותו תא במהלך חשיפה למסך ריק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings at JoVE.com

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

פרוטוקול זה מתאר הליך לבניית מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות וחריפות ב- vivo בעכבר(שרירים)וחמוס(Mustela putorius furo) מאזורי מוח מרובים. כל שלב, לאחר רכישת סיבי פחמן גולמיים להשתלת מערך microelectrode, מתואר בפירוט, בדגש על בניית מערך microelectrode.

הקמה ויישום של מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות כרוניות וחריפות ב-Vivo

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

הבנייה העליונה של הספסל המתוארת כאן היא אחת מטכנולוגיות האלקטרודה הבודדות הקיימות כיום המאפשרות הקלטות מאשכולות צפופים של נוירונים ולעקוב אחר רבים מאותם נוירונים לאורך זמן. מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן הם זולים לבנות. הם קטנים, תואמים ביולוגית, וזזים עם המוח, מה שמאפשר הקלטות בריאות ויציבות.סיבי פחמן הם דקים מאוד ובהתחלה, הם מאוד קשה לראות. עם זאת, לאחר כמה ימים של עבודה איתם, הם הופכים קלים יותר לתמרן. ראשית, הנח חתיכת סרט דו-צדדי על שני צדדים ארוכים של הקלטת, תוך יישור קצה הקלטת עם הקצה הפנימי של הקלטת.כדי להכין כלי מניפולציה סיבי פחמן, לעטוף חתיכה קטנה של סרט דבק סביב מחט 30 מד כדי ליצור נקודה חדה אך גמישה עם הסרט. לאחר מכן, להפריד סיבים בודדים מן החבילה אפויה ולהניח אותם במקביל לצד הקצר של הקלטת שמירה על מרחק של שניים עד שלושה מילימטר. לאחר הבטחת התאמת 20 עד 30 סיבים על כל קלטת, לאטום את הסיבים במקום על ידי הנחת סרט ברור על קלטת מקל כפול, ומניחים את הקלטות מלאות במחזיק הקלטה.כדי להרכיב את מערך המיקרו-ectrode של סיבי הפחמן, התחל להאכיל כל חוט הארקה דרך הערוץ המתאים בקצה המחבר של הג'יג והמשיך עד ששני קצוות שווים באורך. ואז לסובב אותם יחד כדי לאבטח אותם על ג'יג. החל מלט שיניים UV נרפא כדי לאבטח את החוט תוך הקפדה לא לקבל כל מלט שיניים בתוך הערוץ הפתוח שממנו החוט מוזן דרך.השתמש בשרביט ריפוי UV כדי לרפא את המלט הדנטלי במשך 20 שניות וליישר את הג'יג והסגן כך שקצה המחבר, האגן וקצה המשפך נראים לעין. לאחר מכן, כוון את הג'יג כך שהמשפך יצביע הרחק מהמשתמש והמחבר יעמוד מול המשתמש. לאחר מכן החליקו את קצה המחט של 25 מד כנגד הקלטת באתר להסרת הסיבים הפוטנציאלי וחתכו סיבי פחמן בודדים מהקלטת.החזק את הקצה החופשי החתוך הטרי של הסיבים באמצעות כלי סיבי פחמן ושימוש במחט, לחתוך את הקצה השני של הסיבים מן הקלטת. ואז שוב להשתמש בכלי סיבי פחמן כדי להרים את סיבי הפחמן כך קצה אחד הוא על סנטימטר אחד אורך מהכלי. השתמש בכלי סיבי הפחמן המחובר לסיבים כדי להאכיל את הקצה הקצר יותר של הסיבים דרך חתיכת המשפך מהאגן האמצעי של הג'יג.המשך להאכיל את הסיבים דרך משפך ג'יג עד שרוב אורך הסיבים הוא דרך. להאכיל את החלק האחורי של הסיב דרך ערוץ זמין באמצעות כלי סיבי פחמן. ממשיכים להאכיל דרך הגב עד כחמישה מילימטרים של סיבים בולטים או לחתוך לגודל במידת הצורך.כדי להסיר את הבידוד בקצה המחבר, השתמש במצית גלגל ניצוץ סטנדרטי כדי להעביר את הלהבה מעל הסיבים החשופים, ולאחר מכן להאכיל את הסיבים הלהבים דרך הג'יג כך שחלק הסיבים הלהבים נמצא כעת בתוך הערוץ תוך הבטחה כי אין סיבים בולטים מתוך החלק האחורי של הג'יג. החל מלט דנטלי UV נרפא על סיבי האגן של הג'יג כדי למלא את כל האגן, המכסה את הפתחים של שני הערוצים משפך. לאחר הסרת הג'יג מן סגן וכיוון את הג'יג כך המשפך מצביע למטה, לאבטח את הג'יג עם המחבר בסופו של דבר מצביע למעלה.מלא את המחט בהדפס כסף והכניס בזהירות את המחט לערוץ אחד עד שנעצר על ידי הבטון הדנטלי. כדי למלא את הערוץ בצבע, לאט לדכא את המזרק תוך הסרת המחט מן הערוץ, ולאחר מכן לטבול אפליקטור קצה כותנה מדלל צבע ולנקות את הבסיס של משטח ג'יג של כל צבע. כעת הכנס את מחבר שלב הראש בכיוון הנכון על-ידי יישור הפינים לערוצים.ברגע מחבר שלב הראש יושב ישר, זקוף, והוא סמוק כמו ג'יג ככל האפשר, לאבטח את מחבר שלב הראש ל ג'יג על ידי החלת מלט שיניים לאורך הקצה שבו מחבר שלב הראש פוגש את הג'יג, ואז תרופה UV במשך 20 שניות. על מנת לחתוך את קצה האלקטרודה לאורך הרצוי, להוריד את האלקטרודה לתוך של מים deionized או מזוקק עד קצה המשפך הוא שקוע לחלוטין מוחזק נורמלי על פני השטח. עכשיו להביא את סיבי הפחמן בודדים יחד על ידי הסרת האלקטרודה מהמים.הנח את האלקטרודה כך שהסיבים ישכבו סומק על משטח המדריך וחתכו את הסיבים לאורך הרצוי עם אזמל בתנועה מתגלגלת, ואז חברו את האלקטרודה לבוחן העכבה הרב-תכרוד באמצעות המתאם המתאים ובדקו את העכבה. עכשיו להוריד את קצה האלקטרודה כשני מילימטרים לתוך צינור microcentrifuge של 0.1 טוחנת PBS, ולהכניס חוט הארקת לתוך צינור microcentrifuge. כדי להפחית את העכבה של קצה האלקטרודה, להזריק זרם חיובי עם משרעת ומשך שנבחר, ולאחר מכן לשטוף את הסיבים במים deionized או מזוקק לנקות.לאחר מכן, כדי לבצע electroplating בתמיסת ציפוי זהב, להוריד את קצה חבילת אלקטרודה כשני מילימטרים לתוך צינור microcentrifuge בתערובת ציפוי ולהכניס את חוט הארקה לתוך צינור microcentrifuge. לאחר מכן להגדיר פרמטרים מתאימים עבור electroplating. יש לשטוף את הסיבים ביסודיות במים מסולסלים או מזוקקים לאחר אלקטרופלציה.תמונת ה- SEM הייצוגית של סיבי פחמן מוכנים הראתה תמיסה של ציפוי זהב המרוכז בקצה. אלקטרופלינט הסיבים בזהב הביא לירידה בעקיפות המתאימות להקלטה. ערכי עקיפה מ-300 ערוצים לאחר חיתוך ראשוני, הזרקה זרם חיובית ו electroplating הראו ערכי עכום מופחתים לאחר כל שלב עיבוד.משכי זמן מתונים של אלקטרופלינט זהב יצרו את המרבצים הקטנים והמעוגלים על קצות חבילת סיבי הפחמן. בנוסף, פעילות אלקטרופיזיולוגית יציבה בת 64 ערוצים בקליפת המוח הרטרספלנית של עכבר זכר בוגר שמתנהג בחופשיות נותחה. התוצאות הדגימו את העקביות של איכות ההקלטה, זיהוי יחידה יחידה חזקה, עקביות לאורך זמן כפי שמוצג על ידי צורות גל ספייק לא מנורמלות, ורצפת רעש יציבה.כמו כן, מתח גולמי נעוץ 11 חודשים לאחר ההשתלה הראה פוטנציאל שדה מקומי חזק. דוגמה מייצגת של מערך מיקרואלקטרויד סיבי פחמן חריף בן 16 ערוצים המתעד את ההקלטה שנרכשה מקליפת המוח החזותית העיקרית של חמוס נקבה בוגרת מוצגת גם כאן. מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן מאפשרים הקלטה קצרת טווח או כרונית של נוירונים סמוכים במוח לאורך פרקי זמן ארוכים, החיוניים להבנת מעגלים עצביים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

בצפיפות גבוהה הקלטות EEG של העכברים לנוע בחופשיות באמצעות polyimide מבוססי microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

תכנון והרכבה של Microdrive קל במיוחד ממונע להקלטות עצביות כרוניות בבעלי חיים קטנים

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

השרשה כרונית של מערכים גמישים אלקטרודה מרובים

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

כירורגיה סטריאוטקאית עבור השרשה של מערכים מיקרואלקטרודה ב מרמוסטמצוי

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...