Name: construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00
Duration: 7 min 37 s
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Gostaríamos de agradecer a Greg Guitchounts por orientação com projeto e construção de eletrodos e Tim Gardner por abrir seu laboratório e instalações para nós. Gostaríamos de agradecer a Christos Michas por sua ajuda com o uso do PDS na instalação principal de Bio-Interface e Tecnologia e Neil Ritter, Jon Spyreas e David Landesman por sua ajuda no projeto das primeiras versões do gabarito de 16 canais. Gostaríamos de agradecer a Tim Cavanaugh por sua ajuda com a SEM imaging no Center for Harvard Nanoscale Systems em Harvard.

<ol>
	<li>Galvani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , (1791).</li><li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+correspondence+of+electrical+and+optical+physiology+in+in+vivo+population-scale+two-photon+calcium+imaging.">On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging.</a> bioRxiv. , 800102 (2019).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+MEMS+and+microsystem+tools+for+brain+research.">State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research.</a> Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).</li><li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Hong, G., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+electrode+technologies+for+neural+recordings.">Novel electrode technologies for neural recordings.</a> Nature reviews. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+implantable+composite+microelectrodes+with+bioactive+surfaces+for+chronic+neural+interfaces.">Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces.</a> Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).</li><li>Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+recording+and+modulation+technologies.">Neural recording and modulation technologies.</a> Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).</li><li>Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. 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A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux+of+dopamine+from+the+synaptic+cleft+in+the+nucleus+accumbens+of+the+rat+brain.">Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain.</a> Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).</li><li>Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+linear+8.4+&#181;m+diameter+16+channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+single+unit+recordings.">Insertion of linear 8.4 &#181;m diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings.</a> Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).</li><li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives.">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators. 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Os autores não declaram conflitos financeiros de interesse.

Este protocolo descreve cada passo necessário para a construção de um CFEA funcional para uso agudo e crônico. O processo descrito é personalizável às necessidades do pesquisador, tornando-o uma opção acessível e barata para monitorar neurônios únicos ao longo dos meses. O protocolo demonstra a viabilidade de registrar tanto atividade robusta uni unitária em poucos minutos de implantação em um animal anestesiado, quanto ao longo de quatro meses em um animal acordado, comportando-se animal, ilustrando o potencial desses CFEAs para estudar mudanças de curto e longo prazo nas respostas neurais.
As etapas do protocolo descrito foram minuciosamente testadas e aprimoradas ao longo do tempo para produzir um procedimento eficiente que pode ser concluído rapidamente, a um baixo custo marginal (<$100,00), com a capacidade de registrar unidades únicas inequívocas, densamente e compuntura ao longo de meses. As etapas de construção podem ser concluídas em menos de um dia e produzirão sinais eletrofisiológicos comparáveis a qualquer matriz comercial líder. Os CFEAs também têm uma pegada muito menor (pacote de fibras de 16 canais tem um diâmetro de ~26 μm) do que matrizes comerciais similares, e sua biocompatibilidade as torna adequadas para uso a longo prazo13. É importante ressaltar que existem várias etapas e instruções críticas que devem ser seguidas para produzir um CFEA funcional com desempenho comparável.
Devido à fragilidade das fibras de carbono, elas devem ser tratadas com o maior cuidado. Manuseá-los com fórceps afiados ou outras ferramentas pode resultar em quebra das fibras. Além disso, é importante construir os CFEAs em um espaço com movimento de ar limitado para que as fibras não esvaam. Ao queimar a porção traseira das fibras, o isqueiro só precisa ser movido em um movimento de ida e volta muito brevemente, por aproximadamente 1 s. As etapas após essa remoção do isolamento são cruciais para a construção de um eletrodo com canais de trabalho. As pontas flamedas devem ser alimentadas no gabarito sem qualquer contato adicional. Então, ao encher a bacia com cimento dentário, é importante que o cimento seja cuidadosamente aplicado e preencha completamente os canais e a bacia do funil, fechando as aberturas sem preenchê-las. O cimento dental deve então ser completamente curado com luz UV antes de prosseguir. Uma vez que isso esteja completo, a tinta prateada deve ser injetada em cada canal até que esteja completamente preenchida, mas não derramando. Esta é a etapa mais variável do processo. Qualquer excesso de preenchimento pode produzir crosstalk entre canais, e o preenchimento insuficiente pode resultar em uma falha de conexão. Se não conseguir injetar tinta prateada usando uma agulha de 25 G, é provável que a solução seja muito viscosa e, neste caso, uma pequena quantidade de diluente de tinta possa ser adicionada para criar uma solução mais fluida. Uma vez preenchidos todos os canais e o conector do headstage inserido, é importante permitir que a matriz cure por 24 horas antes de fixar o conector com cimento dental. Descobrimos que a falha em fazê-lo reduziu o número de canais conectados. Aplicar uma quantidade generosa de cimento dental também é importante para que o conector não se desconecte ao interagir com o sistema de aquisição de sinal. Se eles se desvincularem, é possível tentar a reconexão com o preenchimento repetido de canais com tinta prateada, mas o usuário deve testar os valores de impedância do CFEA para avaliar o número de canais conectados. Permitir que o cimento dental cure durante a noite também serve para evitar um possível descolamento.
Medir a impedância do eletrodo fornecerá uma estimativa precisa dos canais conectados. Isso pode ser feito depois de submergir o solo e os fios de referência e as pontas de fibra de carbono na PBS. Observamos que uma alta impedância (>15 MΩ) é indicativa de um canal aberto e desconectado. Antes de injetar corrente e eletroplacamento, um canal conectado pode ter uma gama de valores de impedância que devem diminuir significativamente com esse processo. O número médio de canais conectados (impedância < 4 MΩ após a injeção atual) por eletrodo de 16 canais foi de 12,96 ± 2,74 (média ± SD; N = 48 eletrodos). Foram testados vários tempos de eletroplacar, e 30 s produziram isolamento de sinal superior entre os locais de gravação(Figura 5). Embora tenha sido bem estabelecido que pEDOT-pTS12,24,25,26 e PEDOT-TFB21 fornecem opções confiáveis para a preparação de locais de gravação de fibra de carbono, descobrimos que o revestimento com ouro, um método comprovado e confiável para eletrodos eletroplatados para implantação crônica27,28 , aumentou a facilidade de implantação e impediu que as pontas do eletrodo se agrupassem. Na produção de valores de impedância final inferiores a 0,2 MΩ em média, este método se mostra comparável aos valores alcançados utilizando PEDOT-TFB21 e PEDOT-pTS26.
Ao implantar a matriz de microeletrodes, é importante acompanhar visualmente a inserção das pontas de fibra de carbono sob o microscópio. A inserção bem sucedida deve ser aparente, sem dobra das fibras. Se as fibras parecem estar se curvando, é improvável que elas entrem com sucesso no cérebro. Neste caso, o ângulo da sonda deve ser ajustado para uma segunda tentativa. Este processo pode continuar até que a inserção da sonda seja bem sucedida. Uma vez que o eletrodo esteja na profundidade desejada, descobrimos que esperar pelo menos 30 min permitirá que a sonda se contente com a aquisição ideal de sinal (gravações agudas).
Os CFEAs descreveram, além de sua pequena pegada e biocompatibilidade, oferecer uma alternativa robusta e personalizável aos arrays comerciais devido à sua facilidade de construção e baixo custo. A maior limitação para os CFEAs detalhados neste protocolo é sua escalabilidade. Devido à natureza manual de sua construção, escalar até projetos com centenas de locais de gravação pode não ser prático. Além disso, os avanços na fabricação de matrizes de microeletrodos usando nanotecnologia permitirão registros populacionais de maior escala do que os métodos descritos aqui. No entanto, este protocolo oferece acessibilidade cfea a laboratórios interessados na fabricação de bancada de eletrodos de fibra de carbono. Não observada perda de estabilidade ou diminuição da robustez na amplitude do pico ao longo da duração dos experimentos crônicos de 120 dias, como indicado por um único canal representativo típico de nossas observações nessa escala de tempo(Figura 6A-E). Além disso, os CFEAs mostram a capacidade de atividade uni unitária persistente, uma vez que quatro unidades únicas permaneceram perceptíveis 11 meses após a implantação no camundongo (Figura 6G,H). Também é possível obter gravações estáveis, uni unitárias agudamente(Figura 7),o que oferece uma vantagem sobre muitos outros eletrodos comerciais para o estudo de neurônios únicos em períodos curtos. No futuro, o desenvolvimento de sondas tão flexíveis e biocompatíveis com diâmetros mínimos permitirá o estudo de processos complexos. Essas ferramentas fornecerão utilidade substancial no avanço da tecnologia neural, incluindo aplicações em interfaces cérebro-máquina (IMC), que requerem estabilidade contínua e de longo prazo29.

Eletrodos e matrizes de eletrodos são ferramentas valiosas para entender como o cérebro processa informações no nível neuronal. Embora as gravações eletrofisiológicas tenham sido alcançáveis por mais de dois séculos1,ainda não é possível medir simultaneamente a atividade de circuitos neurais inteiros na resolução espacial e temporal necessária para capturar o espigão de neurônios individuais. Embora métodos não invasivos, como a eletroencefalografia2,topografia de emissão de pósitrons3, e ressonância magnética funcional4 permitam medições cerebrais integrais, não conseguem alcançar a resolução espacial e temporal necessária para resolver a atividade dos circuitos neurais2,5. Em contraste, métodos de imagem como imagens ópticas usando corantes sensíveis à tensão ou indicadores de cálcio geneticamente codificados podem alcançar resolução espacial uni unitária, mas apresentam problemas como baixa resolução temporal e pouca seletividade3,4,5,6. Gravações elétricas são uma alternativa poderosa a esses métodos. Os eletrodos de gravação fornecem resolução temporal incomparável e permitem ao usuário fazer medições com precisão de tempo de pico em qualquer região do cérebro7. Além disso, matrizes multielerodas cronicamente implantadas (MEAs) permitem em larga escala (dezenas a centenas de células), gravações unicelulares em animais comportados durante um período de dias atémeses 8,9. No entanto, sondas de silício que registram em densidades mais altas têm uma grande pegada e são altamente invasivas, e matrizes cronicamente implantadas muitas vezes geram uma resposta de inflamação, encapsulamento tecidual e morte neuronal10,11,12,13.
As limitações dos eletrodos existentes resultaram em inovações recentes que permitem gravações estáveis, de alta resolução e de longo prazo. Eletrodos típicos consistem em um condutor metálico, como tungstênio ou iídio de platina, ou são à base de silício ou polímero. Embora as matrizes de microfios baseadas em metal possam manter gravações estáveis a longo prazo, elas têm uma pegada muito maior, com um único fio de diâmetro variando de 10-200 μm14. Em contraste, as matrizes de eletrodos à base de silício produzem gravações com alta resolução espacial, mas devido ao seu design relativamente rígido, eles são tipicamente incapazes de manter o sinal e o registro dos mesmos neurônios ao longo de muitosmeses 15. Desenvolvimentos recentes em matrizes baseadas em silício resultaram em eletrodos que podem realizar gravações crônicas de forma confiável, mas essas matrizes não podem ser usadas para gravar de regiões cerebrais profundas em animais maiores e são destinadas a gravações lineares9. Os avanços nos conjuntos de polímeros resultaram em maior flexibilidade e estabilidade de registro de unidades únicas e oferecem o potencial para gravações de alta densidade em um futuro próximo, mas com disponibilidade limitada atualmente8,16,17. As fibras de carbono permitem gravações de alta densidade com materiais fora da prateleira que são descritos aqui.
Microeletrodos de gravação de fibra de carbono são usados há décadas, com os primeiros eletrodos de fibra de carbono consistindo de uma única fibra de carbono inserida em uma micropipette de vidro. Estes microelerodes foram usados para gravações extracelulares uni unitárias, e embora a relação sinal-ruído fosse comparável às melhores microeletrodos de tungstênio em vidro, eram vantajosas devido à sua flexibilidade, valores de impedância mais baixos e simplicidade para fabricar18,19. Os esforços para desenvolver matrizes de eletrodos de fibra de carbono aceleraram recentemente devido às capacidades de biosensação das fibras de carbono. Além do aumento da biocompatibilidade e da condutividade elétrica excepcional, eles apresentam um conjunto único de propriedades, incluindo resistência à alta temperatura, baixa densidade relativa, alta resistência à tração, baixa rigidez de dobra, sensibilidade de alta detecção e uma pequena área transversal10,12. Todas essas propriedades motivaram o desenvolvimento de matrizes de microeletrodos de fibra de carbono (CFEAs) que facilitam registros crônicos, estáveis e de alto rendimento de neurônios únicos. Esses CFEAs agora podem ser criados manualmente20,21 ( Figura1), produzindo matrizes de microeletrídrica que podem conter neurônios únicos ao longo de meses. Descrito aqui é um processo de construção acessível para CFEAs que foi adaptado de duas maneiras para registros agudos e crônicos de neurônios individuais em duas espécies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-15</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel CFEA Jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79014-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-84</td>
			<td>Building tool - sharp-tipped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-03</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing</td>
			<td>Small Parts Inc</td>
			<td>B000FMYN38</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel CFEA jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79022-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 in cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-156</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCad 3D printing software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD disposable syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fibers</td>
			<td>Good Fellow USA</td>
			<td>C 005725</td>
			<td>7 &#956;m epoxy sized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes and cassette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For coating fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowable Dental Composite</td>
			<td>Pentron</td>
			<td>Flow-It ALC</td>
			<td>CFMA component/ UV cured dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold plating solution</td>
			<td>Sifco ASC</td>
			<td>5355</td>
			<td>10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0&#8211;5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewelry clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00GRABH9K</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRClust</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ferret spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>BIC</td>
			<td>LCP62DC</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PS-7000C</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-953-1B</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MountainSort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mouse spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 16-channel adapter</td>
			<td>Multi-channel systems</td>
			<td>ADPT-nanoZ-NN-16</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 32-channel adapter</td>
			<td>White Matter</td>
			<td>NZA-OMN-32 rev A</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ multi-electrode impedance tester</td>
			<td>White Matter</td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Stockroom</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Semi-transparent, flexible film with adhesive properties</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parylene &#39;C&#39; Dimer</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>980130-C-01LBE</td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide tubing</td>
			<td>MicroLumen</td>
			<td>BRAUNI001</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>300124</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver conductive coating</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>842AR Super Shield</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with range 6.7:1</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky notes</td>
			<td>Post-it</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue wipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797550</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing wand</td>
			<td>Woodpecker</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum deposition chamber</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td></td>
			<td>Labcoter 2 (PDS 2010)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings

As matrizes de eletrodos multicanais oferecem uma visão do cérebro em funcionamento e servem para elucidar processos neurais nos níveis unicelulares e circuitos. O desenvolvimento dessas ferramentas é crucial para a compreensão de comportamentos complexos e cognição e para o avanço das aplicações clínicas. No entanto, continua a ser um desafio registrar densamente das populações celulares de forma estável e contínua durante longos períodos de tempo. Muitos eletrodos populares, como tetrodes e matrizes de silício, apresentam grandes diâmetros cruzados que produzem danos após a inserção e provocam respostas crônicas de tecido reativo associadas à morte neuronal, dificultando o registro de atividade neural estável e contínua. Além disso, a maioria dos feixes de fios exibem amplo espaçamento entre os canais, impedindo a gravação simultânea de um grande número de células agrupadas em uma pequena área. As matrizes de microeletrodos de fibra de carbono descritas neste protocolo oferecem uma solução acessível a essas preocupações. O estudo fornece um método detalhado para a fabricação de matrizes de microeletrodos de fibra de carbono que podem ser usados para gravações agudas e crônicas in vivo. As propriedades físicas desses eletrodos as tornam ideais para gravações de longo prazo estáveis e contínuas em altas densidades celulares, permitindo ao pesquisador fazer gravações robustas e inequívocas de unidades únicas ao longo dos meses.

Com a conclusão deste protocolo, serão possíveis gravações estáveis de atividade de espetamento de unidade única. Essas matrizes de microeletrodo são personalizáveis em material, contagem de canais e adaptador de headstage com base nas necessidades do pesquisador. As fibras de eletroplacar em ouro resultam em diminuição das impedâncias adequadas para o registro (Figura 4 e Figura 5). Se o usuário pretende registrar cronicamente, as medições podem ser feitas após a recuperação do animal do procedimento cirúrgico. Os procedimentos crônicos resultaram em gravações estáveis e uni unitárias por pelo menos 120 dias. Uma gravação representativa é mostrada na Figura 6, ilustrando atividade eletrofisiológica estável de 64 canais no córtex retrosplenial de um rato macho adulto livremente comportado. Se uma preparação aguda for planejada, as gravações podem começar logo após a implantação (~30 min). Isso permitirá tempo para o eletrodo se estabelecer no cérebro. A Figura 7 fornece um exemplo representativo de uma gravação aguda de CFEA de 16 canais adquirida do córtex visual primário de um furão feminino adulto. A triagem de espetos no mouse e no furão foi realizada com software de classificação de picos (ver Tabela de Materiais).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg"> Figura 1: Anatomia de matrizes de microeletrodos de fibra de carbono de 16 e 32 canais (CFEAs). O CFEA de 16 canais possui um design estendido para fins de manuseio. O design de 32 canais possui uma face plana que permite que dois gabaritos sejam combinados para um CFEA de 64 canais. Ambos os diagramas têm estruturas de identificação rotuladas com dimensões. A extremidade do conector indica a localização da inserção do conector e os canais GND/REF indicam onde o fio de aterramento está inserido. A bacia do funil refere-se ao local pelo qual as fibras passam para serem sobrepostas com cimento dental curado à luz UV, e a ponta do funil significa o local de onde as fibras saem do gabarito. A ponta do funil é dividida em quadrantes para minimizar as fibras que se agarram e criam danos. As fibras são posteriormente puxadas para um único pacote com o uso do cimento dentário. Os gabaritos são impressos em 3D usando impressoras de resina SLA. Os diagramas são ampliados para mostrar detalhes. (B) CFEA construída. O diagrama identificou estruturas rotuladas. A ponta do feixe azul representa o segmento das fibras de carbono que adquirem medidas de gravação. O cinza dentro da bacia do funil e ao redor do conector é indicativo de cimento dental curado à luz UV que mantém fibras de carbono no lugar na bacia do funil e protege o conector ao gabarito. O fio roxo representa o fio de aterramento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg"> Figura 2: Carregamento de fibras de carbono bruto em para revestimento de parileno C. (A) As fibras de carbono são carregadas em cartuchos sobrepostos com duas tiras de fita dupla face (azul). Cada é carregado com ~25 fibras. (B) As fitas são carregadas em um suporte de corte a laser (cinza) em preparação para o revestimento de parileno C. Cada um tem dez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg"> Figura 3: O esquema de construção do pacote de microeletrônico de fibra de carbono (CFEA) (A) 16 fibras de carbono revestidas individuais (pretas) são roscadas através do gabarito impresso em 3D de 32 canais (cinza). (B) As pontas de fibra de carbono são cortadas com micro-tesoura, deixando o excesso de fibra igual à altura da base do gabarito, estendendo-se para fora da base do gabarito. (C) Um isqueiro de roda de lha de plástico padrão é rapidamente passado sobre o excesso de fibra para remover o isolamento do parileno C. O esquema superior direito mostra a remoção do parileno de 9 das 12 fibras. (D) As fibras são reinseridas no gabarito até que a extremidade da fibra esteja alinhada com a base. O esquema superior direito mostra a reinserção de 9 fibras com pontas de fibra uninsuladas (cinza) alojadas dentro da base do gabarito. O gabarito é então virado e os passos A-D são repetidos para roscar os 16 canais opostos. (E) O gabarito é preenchido com cimento dental para fixar as fibras. A impressão prateada é injetada em cada poço da base do gabarito. (F) O conector masculino é inserido na base do gabarito. (G) CFEA e bisturi estão congelados em um congelador de -20 °C. A ponta do array é cortada ao comprimento desejado, deixando 32 fibras uniformes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg"> Figura 4: Tratamento de ponta e eletroplato. (A) As pontas do eletrodo são primeiramente colocadas em 0,1 M PBS, onde a corrente é passada através de cada eletrodo. As pontas são então enxaguadas e transferidas para uma solução de revestimento de ouro, onde são eletropladas com a correnteza. (B) Imagens SEM de fibra de carbono preparada mostram solução de revestimento de ouro concentrada na ponta. Barra de escala representa 4 μm. (C) Valores de impedância de 168 canais após corte inicial (roxo; 3,11 MΩ ± 0,42 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras), injeção de corrente positiva (rosa; 1,23 MΩ ± 0,36 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras) e eletroplacamento (laranja; 0,19 MΩ ± 0,15 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras) apresentam valores de impedância reduzidos após cada etapa de processamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg"> Figura 5: Durações moderadas de eletroplacar de ouro produzem pequenos depósitos arredondados em pontas de feixe de fibra de carbono. As pontas de fibra de carbono retratadas são todas de diferentes matrizes de microeletrodos, refletindo diferentes durações da corrente injetada para redução de impedância ou revestimento de ouro. Além disso, as imagens retratam o revestimento parileno C, que isola as fibras de carbono e impede qualquer aquisição de sinal de um local diferente das pontas das fibras. (A) Escaneando a imagem da microscopia eletrônica das pontas de fibra de carbono após congelar e fazer um único corte com uma lâmina de barbear. As barras de escala representam 10 μm. (B) Mesmo que A, mas depois seguidas com injeção de correntepositiva para 10 s. (C) Mesmo que B, mas depois eletroplada com ouro por 15 s. (E) Mesmo que B, mas depois eletroplada com ouro para 120 s. Descobrimos que a eletroplacar para 30 s a uma corrente de -0,05 μA foi ótima para gravações eletrofisiológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg"> Figura 6: Gravações extracelulares crônicas em córtex retrosplenial de camundongos com matrizes de microeletrodos de fibra de carbono mostram atividade neural persistente e estável. (A) Foram registrados traços de tensão de onze faixas foram gravados simultaneamente. Os traços subsequentes gravados do primeiro canal (linha superior) são plotados em B para mostrar durabilidade ao longo do tempo. As dez linhas restantes demonstram a consistência da qualidade de gravação e mostram atividade robusta em toda a matriz. A barra de escala à esquerda de cada traço representa um potencial de 200 μV. (B) Dados de bandpassed da mesma fibra que no traço superior em A, expandidos para mostrar atividade robusta em uma gravação contínua de 120 dias. (C) O cluster revela uma detecção robusta de unidade única ao longo de meses. Os traços representam a forma média de onda de uma unidade única representativa continuamente observável ao longo de 120 dias, extraída da fibra plotada em B em cada ponto de tempo. (D) Formas de onda de pico não normalizadas de C empilhadas para demonstrar consistência ao longo do tempo. (E) As gravações de fibra de carbono demonstram um piso de ruído estável ao longo de muitos meses. O desvio padrão do piso de ruído (traço menos atividade de espetamento) em B não mostra nenhuma mudança progressiva no ruído. As barras representam contaminação média. As barras de erro representam desvio padrão. (F) Desenho em escala de um rato com um CFEA cronicamente implantado e headstage. (G) Traço de tensão bruta (topo) 11 meses após a implantação mostra LFP robusto. Traço de tensão com faixa (inferior) mostra atividade neural constante. (H) Forma média de onda de pico do neurônio registrada na fibra de C, subposta pelas primeiras 1.000 incidências de atividade de espetamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg"> Figura 7: Gravações de microeletrodos de fibra de carbono (CFEA) do córtex visual primário do furão. (A) Formas de onda de unidades únicas classificadas de picos registrados a partir de um CFEA de 16 canais. Os potenciais de ação de neurônios únicos eram frequentemente evidentes em múltiplos canais em amplitudes ligeiramente diferentes. (B) Curvas de ajuste de direção a partir de neurônios selecionados. As cores correspondem às unidades registradas em A. Setas indicam a direção do movimento de estímulo. Barras de escala indicam a taxa de resposta. As barras de erro indicam a resposta média com erro padrão. A linha horizontal tracejada representa a taxa de disparo espontânea da mesma célula durante a exposição a uma tela em branco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Este protocolo descreve um procedimento para a construção de matrizes de microeletrodos de fibra de carbono para gravações eletrofisiológicas in vivo crônicas e agudas em camundongos (Mus musculus) e furão(Mustela putorius furo) de múltiplas regiões cerebrais. Cada passo, após a compra de fibras de carbono bruto para implantação de matriz de microeletrodos, é descrito em detalhes, com ênfase na construção de matriz de microeletrodos.

Construção e Implementação de Matrizes de Microeletrodos de Fibra de Carbono para Gravações In Vivo Crônicas e Agudas

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

A construção de bancada descrita aqui é uma das poucas tecnologias de eletrodos disponíveis atualmente que permitem gravações de aglomerados densos de neurônios e seguem muitos desses neurônios ao longo do tempo. As matrizes de microeletrodos de fibra de carbono são baratas de construir. São pequenas, biocompatíveis, e se movem com o cérebro, o que permite gravações saudáveis e estáveis.As fibras de carbono são extremamente finas e, inicialmente, são muito difíceis de ver. No entanto, depois de alguns dias trabalhando com eles, eles se tornam mais fáceis de manipular. Para começar, coloque um pedaço de fita dupla face em dois lados longos do, alinhando a borda da fita com a borda interna do.Para preparar uma ferramenta de manipulação de fibra de carbono, enrole um pequeno pedaço de filme adesivo em torno de uma agulha de calibre 30 para formar um ponto afiado, mas flexível com o filme. Em seguida, separe as fibras individuais do pacote assado e coloque-as paralelamente ao lado curto do mantendo uma distância de dois a três milímetros. Depois de garantir o encaixe de 20 a 30 fibras em cada, sele as fibras no lugar colocando fita clara sobre a fita de vara dupla e coloque as fitas preenchidas no porta-fitas.Para montar a matriz de microeletrodes de fibra de carbono, comece a alimentar cada fio de aterramento através do canal apropriado na extremidade do conector do gabarito e continue até que duas extremidades sejam iguais em comprimento. Em seguida, torcê-los juntos para fixá-los no gabarito. Aplique cimento dental curado por UV para fixar o fio, garantindo não obter cimento dental dentro do canal aberto de onde o fio é alimentado.Use a varinha de cura UV para curar o cimento dental por 20 segundos e alinhar o gabarito e o vício de tal forma que a extremidade do conector, a bacia e a ponta do funil sejam visíveis. Em seguida, oriente o gabarito para que o funil aponte para longe do usuário e o conector acabe de frente para o usuário. Em seguida, deslize a ponta da agulha de calibre 25 contra o no local potencial de remoção de fibras e corte uma única fibra de carbono do.Segure a extremidade livre recém-cortada da fibra usando uma ferramenta de fibra de carbono e usando a agulha, corte a outra extremidade da fibra longe do. Em seguida, use novamente a ferramenta de fibra de carbono para pegar a fibra de carbono de tal forma que uma extremidade tenha cerca de um centímetro de comprimento da ferramenta. Use a ferramenta de fibra de fibra anexada à fibra para alimentar a extremidade mais curta da fibra através da peça do funil da bacia média do gabarito.Continue alimentando a fibra através do funil do gabarito até que a maior parte do comprimento da fibra esteja passando. Alimente a porção traseira da fibra através de um canal disponível usando a ferramenta de fibra de carbono. Continue a se alimentar pela parte de trás até que cerca de cinco milímetros de fibra esteja saindo ou cortada ao tamanho, se necessário.Para remover o isolamento na extremidade do conector, use um isqueiro de roda de centelha padrão para passar a chama sobre as fibras expostas e, em seguida, alimente a fibra inflamada através do gabarito para que a porção de fibra flameada esteja agora dentro do canal, garantindo que nenhuma fibra esteja saindo da parte de trás do gabarito. Aplique cimento dental curado por UV nas fibras da bacia do gabarito para encher toda a bacia, cobrindo as aberturas dos dois canais e funil. Depois de remover o gabarito do vício e orientar o gabarito para que o funil aponte para baixo, fixe o gabarito com a extremidade do conector apontando para cima.Encha a agulha com impressão prateada e insira cuidadosamente a agulha em um canal até parar pelo cimento dentário. Para encher o canal com tinta, deprime lentamente a seringa enquanto retira a agulha do canal, em seguida, mergulhe um aplicador de ponta de algodão no diluente de tinta e limpe a base da superfície do gabarito de qualquer tinta. Agora insira o conector do estágio da cabeça na orientação adequada alinhando os pinos com os canais.Uma vez que o conector do estágio da cabeça fique reto, ereto, e esteja o mais erão possível, fixe o conector do estágio da cabeça ao gabarito, aplicando cimento dental ao longo da borda onde o conector do estágio da cabeça encontra o gabarito, em seguida, cura UV por 20 segundos. Para cortar a ponta do eletrodo ao comprimento desejado, abaixe o eletrodo em um béquer de água desionizada ou destilada até que a ponta do funil esteja totalmente submersa e mantida normal à superfície. Agora una as fibras de carbono individuais removendo o eletrodo da água.Coloque o eletrodo para que as fibras coloquem descarga na superfície guia e corte as fibras ao comprimento desejado com um bisturi em movimento de rolamento, em seguida, conecte o eletrodo ao testador de impedância multieleroda usando o adaptador apropriado e teste a impedância. Agora abaixe a ponta do eletrodo cerca de dois milímetros em um tubo de microcentrifuuge de PBS molar de 0,1, e insira fio de aterramento no tubo de microcentrifuagem. Para reduzir a impedância da ponta do eletrodo, injete uma corrente positiva com a amplitude e duração escolhidas e, em seguida, enxágue as fibras em água desionizada ou destilada para limpar.Em seguida, para realizar a eletroplacar na solução de revestimento de ouro, abaixe a ponta do feixe de eletrodo cerca de dois milímetros no tubo de microcentrifuuagem na mistura de revestimento e insira o fio de aterramento no tubo de microcentrifuuagem. Em seguida, defina parâmetros apropriados para eletroplacar. Enxágüe as fibras completamente com água desionizada ou destilada após a eletroplacar.A imagem representante sem de fibra de carbono preparada mostrou uma solução de revestimento de ouro concentrada na ponta. A eletroplacriação de fibra em ouro resultou em diminuição de impedâncias adequadas para a gravação. Os valores de impedância de 300 canais após o corte inicial, injeção de corrente positiva e eletroplacamento mostraram valores de impedância reduzidos após cada etapa de processamento.Durações moderadas de eletroplacar de ouro produziram os pequenos e arredondados depósitos nas pontas do feixe de fibra de carbono. Além disso, foi analisada atividade eletrofisiológica estável de 64 canais no córtex retrosplenial de um camundongo adulto que se comporta livremente. Os resultados demonstraram a consistência da qualidade de gravação, detecção robusta de unidade única, consistência ao longo do tempo, como mostrado por formas de onda de pico não normalizadas e piso de ruído estável.Além disso, a tensão bruta rastreada 11 meses após a implantação mostrou robusto potencial de campo local. Um exemplo representativo de uma aguda gravação de matriz de fibra de carbono de 16 canais adquirida do córtex visual primário de um furão feminino adulto também é mostrado aqui. As matrizes de microeletrodos de fibra de carbono permitem o registro de curto prazo ou crônico de neurônios próximos no cérebro por longos períodos de tempo, o que é essencial para a compreensão de circuitos neurais.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Gravações de alta densidade EEG dos Ratos movimentando-se livremente usando Polyimide baseado microeletrodos

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Implante crônico de matrizes flexíveis múltiplas do elétrodo do polímero

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

Cirurgia estereotástrica para implante de matrizes de microeletrodos no Marmoset comum (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...