Name: construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Greg Guitchounts por su orientación con el diseño y la construcción de electrodos y a Tim Gardner por abrirnos su laboratorio e instalaciones. Nos gustaría agradecer a Christos Michas por su ayuda con el uso de PDS en las instalaciones centrales de Bio-Interface and Technology y a Neil Ritter, Jon Spyreas y David Landesman por su ayuda en el diseño de las primeras versiones de la plantilla de 16 canales. Nos gustaría agradecer a Tim Cavanaugh por su ayuda con las imágenes SEM en el Centro de Sistemas de Nanoescala de Harvard en Harvard.

<ol>
	<li>Galvani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , (1791).</li><li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature reviews. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+linear+8.4+&#181;m+diameter+16+channel+carbon+fiber+electrode+arrays+for+single+unit+recordings.">Insertion of linear 8.4 &#181;m diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings.</a> Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).</li><li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives.">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li><li>Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-plated+electrode+with+high+scratch+strength+for+electrophysiological+recordings.">Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).</li><li>Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-machine+interfaces:+From+basic+science+to+neuroprostheses+and+neurorehabilitation.">Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).</li></ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses financieros.

Este protocolo describe cada paso necesario para construir un ACG funcional tanto para uso agudo como crónico. El proceso descrito es personalizable a las necesidades del investigador, por lo que es una opción accesible y económica para monitorear neuronas individuales durante meses. El protocolo demuestra la viabilidad de registrar tanto la actividad robusta de una sola unidad a los pocos minutos de la implantación en un animal anestesiado, como a lo largo de cuatro meses en un animal despierto y de comportamiento, lo que ilustra el potencial de estos CFEA para estudiar los cambios a corto y largo plazo en las respuestas neuronales.
Los pasos del protocolo descritos han sido probados a fondo y mejorados con el tiempo para producir un procedimiento eficiente que se puede completar rápidamente, a un bajo costo marginal (< $ 100.00), con la capacidad de registrar unidades individuales inequívocas, densa y estable durante meses. Los pasos de construcción se pueden completar en menos de un día y producirán señales electrofisiológicas que son comparables a cualquier matriz comercial líder. Los CFEA también tienen una huella mucho más pequeña (el haz de fibras de 16 canales tiene un diámetro de ~ 26 μm) que las matrices comerciales similares, y su biocompatibilidad las hace adecuadas para el uso a largo plazo13. Es importante destacar que hay varios pasos e instrucciones críticas que deben seguirse para producir un CFEA funcional con un rendimiento comparable.
Debido a la fragilidad de las fibras de carbono, deben manejarse con el máximo cuidado. Manipularlos con pinzas afiladas u otras herramientas puede provocar la rotura de las fibras. Además, es importante construir los CFEA en un espacio con movimiento de aire limitado para que las fibras no se desvanezcan. Al quemar la parte posterior de las fibras, el encendedor solo necesita moverse en un movimiento de ida y vuelta muy brevemente, durante aproximadamente 1 s. Los pasos que siguen a esta eliminación del aislamiento son cruciales para construir un electrodo con canales de trabajo. Las puntas flameadas deben introducirse en la plantilla sin ningún contacto adicional. Luego, al llenar el lavabo con cemento dental, es importante que el cemento se aplique cuidadosamente y llene completamente los canales y el recipiente del embudo, cerrando las aberturas sin llenarlas. El cemento dental debe curarse completamente con luz UV antes de continuar. Una vez que esto se haya completado, se debe inyectar pintura plateada en cada canal hasta que esté completamente lleno, pero sin derramarse. Este es el paso más variable en el proceso. Cualquier llenado excesivo puede producir diafonía entre canales, y un llenado insuficiente puede provocar una falla en la conexión. Si no puede inyectar pintura plateada con una aguja de 25 G, es probable que la solución sea demasiado viscosa y, en este caso, se puede agregar una pequeña cantidad de diluyente de pintura para crear una solución más fluida. Una vez que se llenan todos los canales y se inserta el conector del cabezal, es importante permitir que la matriz se cure durante 24 h antes de asegurar el conector con cemento dental. Descubrimos que el hecho de no hacerlo redujo el número de canales conectados. La aplicación de una cantidad generosa de cemento dental también es importante para que el conector no se desconecte al interactuar con el sistema de adquisición de señal. Si se desprenden, es posible intentar la reconexión con el llenado repetido de canales con pintura plateada, pero el usuario debe probar los valores de impedancia del CFEA para evaluar el número de canales conectados. Permitir que el cemento dental se cure durante la noche también sirve para prevenir posibles desprendimientos.
La medición de la impedancia del electrodo proporcionará una estimación precisa de los canales conectados. Esto se puede hacer después de sumergir los cables de tierra y referencia y las puntas de fibra de carbono en PBS. Hemos observado que una alta impedancia (>15 MΩ) es indicativa de un canal abierto y no conectado. Antes de inyectar corriente y galvanoplastia, un canal conectado puede tener un rango de valores de impedancia que deberían disminuir significativamente con este proceso. El número promedio de canales conectados (impedancia < 4 MΩ después de la inyección de corriente) por electrodo de 16 canales fue de 12,96 ± 2,74 (promedio ± SD; N = 48 electrodos). Se probaron varios tiempos de galvanoplastia, y 30 s produjeron un aislamiento de señal superior entre los sitios de grabación(Figura 5). Si bien se ha establecido bien que PEDOT-pTS12,24,25,26 y PEDOT-TFB21 proporcionan opciones confiables para preparar sitios de grabación de fibra de carbono, encontramos que el chapado con oro, un método probado y confiable para galvanoplastia electrodos para implantación crónica27,28 , aumentó la facilidad de implantación y evitó que las puntas de los electrodos se aglutinaran. Al producir valores de impedancia final de menos de 0,2 MΩ en promedio, este método resulta comparable a los valores alcanzados utilizando PEDOT-TFB21 y PEDOT-pTS26.
Al implantar la matriz de microelectrodos, es importante seguir visualmente la inserción de las puntas de fibra de carbono bajo el microscopio. La inserción exitosa debe ser evidente, sin flexión de las fibras. Si las fibras parecen estar pandeándose, es poco probable que entren con éxito en el cerebro. En este caso, el ángulo de la sonda debe ajustarse para un segundo intento. Este proceso puede continuar hasta que la inserción de la sonda sea exitosa. Una vez que el electrodo está a la profundidad deseada, hemos encontrado que esperar al menos 30 minutos permitirá que la sonda se conforme con la adquisición óptima de la señal (grabaciones agudas).
Los CFEA descritos, además de su pequeña huella y biocompatibilidad, ofrecen una alternativa robusta y personalizable a las matrices comerciales debido a su facilidad de construcción y bajo costo. La mayor limitación a los CFEA detallados en este protocolo es su escalabilidad. Debido a la naturaleza manual de su construcción, escalar a diseños con cientos de sitios de grabación puede no ser práctico. Además, los avances en la fabricación de matrices de microelectrodos utilizando nanotecnología permitirán registros de población a mayor escala que los métodos descritos aquí. Sin embargo, este protocolo ofrece accesibilidad CFEA a los laboratorios interesados en la fabricación de electrodos de fibra de carbono. No observamos pérdida de estabilidad o disminución de la robustez en la amplitud del pico durante la duración de los experimentos crónicos de 120 días, como lo indica un canal único representativo típico de nuestras observaciones en esa escala de tiempo(Figura 6A-E). Además, los CFEA muestran la capacidad de actividad persistente de una sola unidad, ya que cuatro unidades individuales permanecieron discernibles 11 meses después de la implantación enratones (Figura 6G,H). También es posible obtener grabaciones estables de una sola unidad de forma aguda(Figura 7),lo que ofrece una ventaja sobre muchos otros electrodos comerciales para el estudio de neuronas individuales en períodos cortos de tiempo. En el futuro, el desarrollo de estas sondas flexibles y biocompatibles con diámetros mínimos permitirá el estudio de procesos complejos. Estas herramientas proporcionarán una utilidad sustancial en el avance de la tecnología neuronal, incluidas las aplicaciones en interfaces cerebro-máquina (IMC), que requieren estabilidad continua a largo plazo29.

Los electrodos y las matrices de electrodos son herramientas valiosas para comprender cómo el cerebro procesa la información a nivel neuronal. Si bien los registros electrofisiológicos han sido alcanzables durante más de dos siglos1, todavía no es posible medir simultáneamente la actividad de circuitos neuronales completos a la resolución espacial y temporal requerida para capturar el pico de neuronas individuales. Aunque los métodos no invasivos, como la electroencefalografía2,la topografía de emisión de positrones3y la resonancia magnética funcional4 permiten mediciones de todo el cerebro, no pueden lograr la resolución espacial y temporal necesaria para resolver la actividad de los circuitos neuronales2,5. Por el contrario, los métodos de imagen como las imágenes ópticas que utilizan colorantes sensibles al voltaje o los indicadores de calcio codificados genéticamente pueden lograr una resolución espacial de una sola unidad, pero plantean problemas como la baja resolución temporal y la mala selectividad3,4,5,6. Las grabaciones eléctricas son una poderosa alternativa a estos métodos. Los electrodos de grabación proporcionan una resolución temporal sin precedentes y permiten al usuario realizar mediciones con precisión de tiempo de pico en cualquier región del cerebro7. Además, las matrices multielectrodos implantadas crónicamente (MEA) permiten registros a gran escala (decenas a cientos de células) de una sola célula en animales que se comportan durante un período de días ameses 8,9. Sin embargo, las sondas de silicio que registran a densidades más altas tienen una gran huella y son altamente invasivas, y las matrices implantadas crónicamente a menudo generan una respuesta de inflamación, encapsulación de tejidos y muerte neuronal10,11,12,13.
Las limitaciones de los electrodos existentes han dado lugar a innovaciones recientes que permiten grabaciones estables, de alta resolución y a largo plazo. Los electrodos típicos consisten en un conductor metálico, como tungsteno o platino-iridio, o son a base de silicio o polímero. Si bien las matrices de microcables a base de metal pueden mantener grabaciones estables a largo plazo, tienen una huella mucho mayor, con un diámetro de un solo cable que oscila entre 10 y 200 μm14. Por el contrario, las matrices de electrodos basadas en silicio producen grabaciones con alta resolución espacial, pero debido a su diseño relativamente rígido, generalmente no pueden mantener la señal y grabar desde las mismas neuronas durante muchosmeses 15. Los desarrollos recientes en matrices basadas en silicio han dado como resultado electrodos que pueden realizar grabaciones crónicas de manera confiable, pero estas matrices no se pueden usar para grabar desde regiones cerebrales profundas en animales más grandes y están destinadas a grabaciones lineales9. Los avances en las matrices de polímeros han dado como resultado una mayor flexibilidad y estabilidad de registro de unidades individuales y ofrecen el potencial de grabaciones de alta densidad en un futuro próximo, pero con una disponibilidad limitada en la actualidad8,16,17. Las fibras de carbono permiten grabaciones de alta densidad con materiales listos para usar que se describen aquí.
Los microelectrodos de grabación de fibra de carbono se han utilizado durante décadas, con los primeros electrodos de fibra de carbono que consisten en una sola fibra de carbono insertada en una micropipeta de vidrio. Estos microelectrodos se utilizaron para grabaciones extracelulares de una sola unidad, y aunque la relación señal-ruido era comparable a los mejores microelectrodos de tungsteno en vidrio, eran ventajosos debido a su flexibilidad, valores de impedancia más bajos y simplicidad para fabricar18,19. Los esfuerzos para desarrollar matrices de electrodos de fibra de carbono se han acelerado recientemente debido a las capacidades de biodetección de las fibras de carbono. Además de su mayor biocompatibilidad y conductividad eléctrica excepcional, cuentan con un conjunto único de propiedades, que incluyen resistencia a altas temperaturas, baja densidad relativa, alta resistencia a la tracción, baja rigidez a la flexión, alta sensibilidad de detección y una pequeña área de sección transversal10,12. Todas estas propiedades han motivado el desarrollo de matrices de microelectrodos de fibra de carbono (CFEA) que facilitan los registros crónicos, estables y de alto rendimiento de neuronas individuales. Tales CFEA ahora se pueden elaborar a mano20, 21(Figura 1),produciendo matrices de microelectrodos que pueden contener neuronas individuales durante meses. Aquí se describe un proceso de construcción accesible para los CFEA que se ha adaptado de dos maneras para registros agudos y crónicos de neuronas individuales en dos especies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-15</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel CFEA Jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79014-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-84</td>
			<td>Building tool - sharp-tipped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-03</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing</td>
			<td>Small Parts Inc</td>
			<td>B000FMYN38</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel CFEA jig</td>
			<td>Realize Inc.</td>
			<td></td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel Omnetics connector</td>
			<td>Omnetics</td>
			<td>A79022-001</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 in cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-156</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCad 3D printing software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD disposable syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fibers</td>
			<td>Good Fellow USA</td>
			<td>C 005725</td>
			<td>7 &#956;m epoxy sized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes and cassette holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For coating fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowable Dental Composite</td>
			<td>Pentron</td>
			<td>Flow-It ALC</td>
			<td>CFMA component/ UV cured dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold plating solution</td>
			<td>Sifco ASC</td>
			<td>5355</td>
			<td>10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0&#8211;5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewelry clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00GRABH9K</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JRClust</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ferret spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>BIC</td>
			<td>LCP62DC</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PS-7000C</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-953-1B</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MountainSort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mouse spike sorting software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 16-channel adapter</td>
			<td>Multi-channel systems</td>
			<td>ADPT-nanoZ-NN-16</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ 32-channel adapter</td>
			<td>White Matter</td>
			<td>NZA-OMN-32 rev A</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZ multi-electrode impedance tester</td>
			<td>White Matter</td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Stockroom</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Semi-transparent, flexible film with adhesive properties</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parylene &#39;C&#39; Dimer</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>980130-C-01LBE</td>
			<td>For coating raw fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroplating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide tubing</td>
			<td>MicroLumen</td>
			<td>BRAUNI001</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>300124</td>
			<td>For guide tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver conductive coating</td>
			<td>MG Chemicals</td>
			<td>842AR Super Shield</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope with range 6.7:1</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky notes</td>
			<td>Post-it</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue wipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797550</td>
			<td>CFMA component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing wand</td>
			<td>Woodpecker</td>
			<td></td>
			<td>Building tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum deposition chamber</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td></td>
			<td>Labcoter 2 (PDS 2010)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and implementation of carbon fiber microelectrode arrays for chronic and acute in vivo recordings

Las matrices de electrodos multicanal ofrecen información sobre el cerebro en funcionamiento y sirven para dilucidar los procesos neuronales a nivel de una sola célula y circuito. El desarrollo de estas herramientas es crucial para comprender los comportamientos complejos y la cognición y para avanzar en las aplicaciones clínicas. Sin embargo, sigue siendo un desafío registrar densamente de las poblaciones celulares de manera estable y continua durante largos períodos de tiempo. Muchos electrodos populares, como los tetrodos y las matrices de silicio, presentan grandes diámetros cruzados que producen daño al insertarse y provocan respuestas tisulares reactivas crónicas asociadas con la muerte neuronal, lo que dificulta el registro de una actividad neuronal estable y continua. Además, la mayoría de los haces de cables exhiben un amplio espaciado entre canales, lo que impide la grabación simultánea de un gran número de células agrupadas en un área pequeña. Las matrices de microelectrodos de fibra de carbono descritas en este protocolo ofrecen una solución accesible a estas preocupaciones. El estudio proporciona un método detallado para fabricar matrices de microelectrodos de fibra de carbono que se pueden utilizar tanto para registros agudos como crónicos in vivo. Las propiedades físicas de estos electrodos los hacen ideales para grabaciones estables y continuas a largo plazo a altas densidades celulares, lo que permite al investigador realizar grabaciones robustas e inequívocas de unidades individuales a lo largo de meses.

Con la finalización de este protocolo, será posible realizar grabaciones estables de la actividad de aumento de una sola unidad. Estas matrices de microelectrodos son personalizables en material, recuento de canales y adaptador de cabecera en función de las necesidades del investigador. La galvanoplastia de fibras en oro da como resultado una disminución de las impedancias adecuadas para el registro(Figura 4 y Figura 5). Si el usuario tiene la intención de registrar crónicamente, las mediciones se pueden realizar después de que el animal se haya recuperado del procedimiento quirúrgico. Los procedimientos crónicos han dado como resultado registros estables de una sola unidad durante al menos 120 días. En la Figura 6se muestra un registro representativo que ilustra la actividad electrofisiológica estable de 64 canales en la corteza retroesplenial de un ratón macho adulto que se comporta libremente. Si se pretende una preparación aguda, las grabaciones pueden comenzar poco después de la implantación (~ 30 min). Esto dará tiempo para que el electrodo se asiente en el cerebro. La Figura 7 proporciona un ejemplo representativo de un registro agudo de AECA de 16 canales adquirido de la corteza visual primaria de un hurón hembra adulto. La clasificación de espigas en ratones y hurones se realizó con software de clasificación de espigas (ver Tabla de Materiales).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg"> Figura 1: Anatomía de matrices de microelectrodos de fibra de carbono de 16 y 32 canales (CFEA). (A) Esquemas de CFEA de 32 canales (arriba) y 16 canales (abajo) desde tres puntos de vista diferentes. El CFEA de 16 canales presenta un diseño extendido para fines de manipulación. El diseño de 32 canales presenta una cara plana que permite combinar dos plantillas para un CFEA de 64 canales. Ambos diagramas tienen estructuras de identificación etiquetadas con dimensiones. El extremo del conector indica la ubicación de la inserción del conector, y los canales GND/REF indican dónde se inserta el cable de conexión a tierra. La cuenca del embudo se refiere a la ubicación por la que pasan las fibras para ser superpuestas con cemento dental curado con luz UV, y la punta del embudo significa el sitio desde donde las fibras salen de la plantilla. La punta del embudo se divide en cuadrantes para minimizar las fibras que se adhieren entre sí y crean daños. Las fibras se extraen más tarde en un solo haz con el uso del cemento dental. Las plantillas se imprimen en 3D utilizando impresoras de resina SLA. Los diagramas se amplían para mostrar detalles. B)CFEA construido. El diagrama tiene estructuras de identificación etiquetadas. La punta azul del haz representa el segmento de las fibras de carbono que adquieren mediciones de registro. El gris dentro de la cuenca del embudo y que rodea el conector es indicativo de cemento dental curado con luz UV que mantiene las fibras de carbono en su lugar en la cuenca del embudo y asegura el conector a la plantilla. El cable púrpura representa el cable de conexión a tierra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg"> Figura 2: Carga de fibras de carbono en bruto en casetes para el recubrimiento de parileno C. (A) Las fibras de carbono se cargan en cartuchos superpuestos con dos tiras de cinta de doble cara (azul). Cada casete está cargado con ~25 fibras. (B) Los casetes se cargan en un soporte cortado con láser (gris) en preparación para el recubrimiento de parileno C. Cada uno contiene diez casetes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg"> Figura 3: Esquema de construcción de paquetes de matriz de microelectrodos de fibra de carbono (CFEA). (A) 16 fibras de carbono individuales recubiertas (negro) se roscan a través de la plantilla impresa en 3D de 32 canales (gris). (B)Las puntas de fibra de carbono se cortan con micro-tijeras, dejando el exceso de fibra igual a la altura de la base de la plantilla, extendiéndose fuera de la base de la plantilla. (C)Un encendedor de rueda de chispa de plástico estándar se pasa rápidamente sobre el exceso de fibra para eliminar el aislamiento de parileno C. El esquema superior derecho muestra la eliminación de parileno de 9 de las 12 fibras. (D) Las fibras se reinsertan en la plantilla hasta que el extremo de la fibra está al ras de la base. El esquema superior derecho muestra la reinserción de 9 fibras con puntas de fibra sin aislamiento (gris) alojadas dentro de la base de la plantilla. Luego se da la vuelta a la plantilla y se repiten los pasos A-D para enhebrar los 16 canales opuestos. (E) La plantilla se rellena con cemento dental para asegurar las fibras. La impresión de plata se inyecta en cada pozo de la base de la plantilla. (F) El conector macho se inserta en la base de la plantilla. (G) El ACE CFA y el bisturí se congelan en un congelador de -20 °C. La punta de la matriz se corta a la longitud deseada, dejando 32 fibras pares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg"> Figura 4: Tratamiento de puntas y galvanoplastia. (A) Las puntas de los electrodos se colocan primero en PBS de 0,1 M, donde la corriente pasa a través de cada electrodo. Las puntas se enjuagan y se transfieren a una solución de baño de oro, donde se galvanizan con la corriente. (B) Las imágenes SEM de fibra de carbono preparada muestran una solución de chapado en oro concentrada en la punta. La barra de escala representa 4 μm. (C) Los valores de impedancia de 168 canales después del corte inicial (púrpura; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras), inyección de corriente positiva (rosa; 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras) y galvanoplastia (naranja; 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ, mediana ± SE, n = 168 fibras) muestran valores de impedancia disminuidos después de cada paso de procesamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg"> Figura 5: Lasduraciones moderadas de galvanoplastia de oro producen depósitos pequeños y redondeados en las puntas de los haces de fibra de carbono. Las puntas de fibra de carbono que se muestran son todas de diferentes matrices de microelectrodos, lo que refleja diferentes duraciones de la corriente inyectada para la reducción de la impedancia o el baño de oro. Las imágenes también representan el revestimiento de parileno C, que aísla las fibras de carbono y evita cualquier adquisición de señal de una ubicación que no sea las puntas de las fibras. (A)Imagen de microscopía electrónica de barrido de puntas de fibra de carbono después de congelar y hacer un solo corte con una cuchilla de afeitar. Las barras de escala representan 10 μm. (B) Igual que A pero luego seguidas con inyección de corriente positiva durante 10 s. (C) Igual que B pero luego galvanizado con oro durante 5 s. (D) Igual que B pero luego galvanizado con oro durante 15 s. (E) Igual que B pero luego galvanizado con oro durante 30 s. (F) Igual que B pero luego galvanizado con oro durante 120 s. Encontramos que la galvanoplastia durante 30 s a una corriente de -0,05 μA fue óptima para los registros electrofisiológicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg"> Figura 6: Las grabaciones extracelulares crónicas en la corteza retroesplenial del ratón que se comporta libremente con matrices de microelectrodos de fibra de carbono muestran una actividad neuronal persistente y estable. (A) Se registraron simultáneamente once trazas de voltaje de banda pasada. Las trazas posteriores registradas desde el primer canal (fila superior) se trazan en B para mostrar la durabilidad a través del tiempo. Las diez filas restantes demuestran la consistencia de la calidad de grabación y muestran una actividad robusta en toda la matriz. La barra de escala a la izquierda de cada traza representa un potencial de 200 μV. (B)Datos de banda cruzada de la misma fibra que en la traza superior en A, expandidos para mostrar una actividad robusta a lo largo de una grabación continua de 120 días. (C) La agrupación en clústeres revela una detección robusta de una sola unidad durante meses. Las trazas representan la forma de onda promedio de una unidad única representativa continuamente observable a lo largo de 120 días, extraída de la fibra trazada en B en cada punto de tiempo. (D) Media, formas de onda de pico no normalizadas de C apiladas para demostrar consistencia a lo largo del tiempo. (E) Las grabaciones de fibra de carbono demuestran un suelo de ruido estable durante muchos meses. La desviación estándar del piso de ruido (traza menos actividad de aumento) en B no muestra un cambio progresivo en el ruido. Las barras representan la contaminación media. Las barras de error representan la desviación estándar. (F) Dibujo a escala de un ratón con un CFEA implantado crónicamente y un estadio. (G) La traza de voltaje bruto (arriba) 11 meses después de la implantación muestra LFP robusta. La traza de voltaje por banda (abajo) muestra una actividad neuronal constante. (H) Forma de onda de pico medio de la neurona registrada en la fibra de C, subyacente por las primeras 1.000 incidencias de actividad de aumento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg"> Figura 7:Grabaciones de la matriz de microelectrodos de fibra de carbono (CFEA) de la corteza visual primaria del hurón. (A) Formas de onda de unidades individuales clasificadas por picos registradas a partir de un CFEA de 16 canales. Los potenciales de acción de neuronas individuales a menudo eran evidentes en múltiples canales a amplitudes ligeramente diferentes. (B) Curvas de ajuste de dirección de neuronas seleccionadas. Los colores corresponden a unidades registradas en A. Las flechas indican la dirección del movimiento del estímulo. Las barras de escala indican la tasa de respuesta. Las barras de error indican la respuesta media con error estándar. La línea discontinua horizontal representa la velocidad de disparo espontáneo de la misma celda durante la exposición a una pantalla en blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Este protocolo describe un procedimiento para construir matrices de microelectrodos de fibra de carbono para registros electrofisiológicos in vivo crónicos y agudos en ratones(Mus musculus)y hurones(Mustela putorius furo) de múltiples regiones cerebrales. Cada paso, después de la compra de fibras de carbono en bruto para la implantación de matrices de microelectrodos, se describe en detalle, con énfasis en la construcción de matrices de microelectrodos.

Construcción e implementación de matrices de microelectrodos de fibra de carbono para grabaciones in vivo crónicas y agudas

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

La construcción de sobremesa descrita aquí es una de las pocas tecnologías de electrodos actualmente disponibles que permiten grabaciones de grupos densos de neuronas y siguen a muchas de esas neuronas a lo largo del tiempo. Las matrices de microelectrodos de fibra de carbono son baratas de construir. Son pequeños, biocompatibles y se mueven con el cerebro, lo que permite grabaciones sanas y estables.Las fibras de carbono son extremadamente delgadas e inicialmente, son muy difíciles de ver. Sin embargo, después de unos días de trabajar con ellos, se vuelven más fáciles de manipular. Para empezar, coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en dos lados largos del cassette, alineando el borde de la cinta con el borde interior del cassette.Para preparar una herramienta de manipulación de fibra de carbono, envuelva un pequeño trozo de película adhesiva alrededor de una aguja de calibre 30 para formar un punto afilado pero flexible con la película. A continuación, separe las fibras individuales del paquete horneado y colóquelas paralelas con el lado corto del cassette manteniendo una distancia de dos a tres milímetros. Después de asegurar la colocación de 20 a 30 fibras en cada cassette, selle las fibras en su lugar colocando cinta transparente sobre la cinta de doble palo y coloque los casetes llenos en el soporte del cassette.Para ensamblar la matriz de microelectrodos de fibra de carbono, comience a alimentar cada cable de conexión a tierra a través del canal apropiado en el extremo del conector de la plantilla y continúe hasta que dos extremos tengan la misma longitud. Luego gírelos juntos para asegurarlos en la plantilla. Aplique cemento dental curado con UV para asegurar el alambre mientras se asegura de no obtener ningún cemento dental dentro del canal abierto desde donde se alimenta el cable.Use la varita de curado UV para curar el cemento dental durante 20 segundos y alinee la plantilla y el vicio de tal manera que el extremo del conector, el recipiente y la punta del embudo sean visibles. A continuación, oriente la plantilla para que el embudo apunte lejos del usuario y el conector termine frente al usuario. Luego deslice la punta de la aguja de calibre 25 contra el cassette en el sitio de eliminación de fibra potencial y corte una sola fibra de carbono del cassette.Sostenga el extremo libre recién cortado de la fibra con una herramienta de fibra de carbono y, con la aguja, corte el otro extremo de la fibra lejos del cassette. Luego, nuevamente, use la herramienta de fibra de carbono para recoger la fibra de carbono de tal manera que un extremo tenga aproximadamente un centímetro de longitud de la herramienta. Use la herramienta de fibra de carbono unida a fibra para alimentar el extremo más corto de la fibra a través de la pieza del embudo desde el recipiente medio de la plantilla.Continúe alimentando la fibra a través del embudo de la plantilla hasta que la mayor parte de la longitud de la fibra haya pasado. Alimente la parte posterior de la fibra a través de un canal disponible utilizando la herramienta de fibra de carbono. Continúe alimentando a través de la parte posterior hasta que unos cinco milímetros de fibra sobresalgan o corten a medida si es necesario.Para quitar el aislamiento en el extremo del conector, use un encendedor de rueda de chispa estándar para pasar la llama sobre las fibras expuestas, luego alimente la fibra flameada a través de la plantilla para que la porción de fibra flameada esté ahora dentro del canal mientras se asegura de que no sobresalgan fibras de la parte posterior de la plantilla. Aplique cemento dental curado con UV a las fibras de la cuenca de la plantilla para llenar toda la cuenca, cubriendo las aberturas de ambos canales y embudo. Después de quitar la plantilla del vicio y orientar la plantilla para que el embudo apunte hacia abajo, asegure la plantilla con el extremo del conector apuntando hacia arriba.Llene la aguja con una impresión de plata e inserte cuidadosamente la aguja en un canal hasta que el cemento dental la detenga. Para llenar el canal con pintura, presione lentamente la jeringa mientras retira la aguja del canal, luego sumerja un aplicador de punta de algodón en el diluyente de pintura y limpie la base de la superficie de la plantilla de cualquier pintura. Ahora inserte el conector del escenario principal en la orientación adecuada alineando los pines con los canales.Una vez que el conector de la etapa principal se siente recto, erguido y esté lo más enjuagado posible a la plantilla, asegure el conector de la etapa principal a la plantilla aplicando cemento dental a lo largo del borde donde el conector de la etapa principal se encuentra con la plantilla, luego cure uv durante 20 segundos. Para cortar la punta del electrodo a la longitud deseada, baje el electrodo en un vaso de precipitados de agua desionizada o destilada hasta que la punta del embudo esté completamente sumergida y se mantenga normal a la superficie. Ahora junte las fibras de carbono individuales eliminando el electrodo del agua.Coloque el electrodo de modo que las fibras queden al ras de la superficie guía y corte las fibras a la longitud deseada con un bisturí en un movimiento de rodadura, luego conecte el electrodo al probador de impedancia multielectrodo utilizando el adaptador apropiado y pruebe la impedancia. Ahora baje la punta del electrodo unos dos milímetros en un tubo de microcentrífuga de PBS molar 0.1 e inserte el cable de conexión a tierra en el tubo de microcentrífuga. Para reducir la impedancia de la punta del electrodo, inyecte una corriente positiva con la amplitud y duración elegidas, y luego enjuague las fibras en agua desionizada o destilada para limpiar.A continuación, para realizar la galvanoplastia en la solución de chapado en oro, baje la punta del haz de electrodos unos dos milímetros en el tubo de la microcentrífuga en la mezcla de chapado e inserte el cable de conexión a tierra en el tubo de la microcentrífuga. A continuación, establezca los parámetros adecuados para la galvanoplastia. Enjuague bien las fibras con agua desionizada o destilada después de la galvanoplastia.La imagen representativa sem de fibra de carbono preparada mostró una solución de baño de oro concentrada en la punta. La galvanoplastia de fibra en oro resultó en una disminución de las impedancias adecuadas para la grabación. Los valores de impedancia de 300 canales después del corte inicial, la inyección de corriente positiva y la galvanoplastia mostraron valores de impedancia disminuidos después de cada paso de procesamiento.Las duraciones moderadas de galvanoplastia de oro produjeron los depósitos pequeños y redondeados en las puntas del haz de fibra de carbono. Además, se analizó la actividad electrofisiológica estable de 64 canales en la corteza retroesplenial de un ratón macho adulto que se comporta libremente. Los resultados demostraron la consistencia de la calidad de grabación, la detección robusta de una sola unidad, la consistencia a lo largo del tiempo como lo demuestran las formas de onda de pico no normalizadas y el piso de ruido estable.Además, el voltaje bruto rastreado 11 meses después de la implantación mostró un sólido potencial de campo local. Un ejemplo representativo de un registro agudo de microelectrodos de fibra de carbono de 16 canales adquirido de la corteza visual primaria de un hurón hembra adulto también se muestra aquí. Las matrices de microelectrodos de fibra de carbono permiten el registro a corto plazo o crónico de neuronas cercanas en el cerebro durante largos períodos de tiempo, lo cual es esencial para comprender los circuitos neuronales.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Alta densidad de registros de EEG de los ratones se mueven libremente con poliamida basado microelectrodos

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Investigación

Neurociencias

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Implantación Crónica de Múltiples Matrices de Electrodos Flexibles de Polímeros

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

Cirugía estereotaxia para la implantación de matrices de microelectrodos en el Marmoset común (Jacchus Callithrix)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...