Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث السويدي (2018-02843) ومؤسسة الدماغ (Fo 2019-0140) ومؤسسة أمراض الشيخوخة في معهد كارولينسكا ومؤسسة غونفور وجوزيف أنيرز ومؤسسة ماغنوس بيرغفالس ومؤسسة غون وبيرتيل ستونيس ومؤسسة توري نيلسون للأبحاث الطبية ومؤسسة مارغريتا إيه أوغلاس ومؤسسة الخدم القدامى.

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة حول هذا البروتوكول في الشكل 2.
1. التعبير وتنقية GST-FKBP51 وGST-FKBP52 (الشكل 2A)
<ol><li>
البلازميدات ملاحظة: الحصول على استنساخ cDNA لFKBP51 الإنسان (معرف استنساخ: 5723416) وFKBP52 الإنسان (استنساخ معرف: 7474554) من اتحاد IMAGE.<ol>
<li>تضخيم...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

هنا نصف بروتوكول باستخدام المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين ، وخاصة FKBP51 و FKBP52. درجة Z العالية (>0.8) توضح متانة وموثوقية تنسيق عالي الإنتاجية. يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من الخرز والبروتين والمرك?...

المرافقين الجزيئية تسهم في التوازن البروتين، بما في ذلك طي البروتين، والنقل، والتدهور. وهي تنظم العديد من العمليات الخلوية وترتبط بالعديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية1. بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هي واحدة من أهم المرافقين الذين تعتمد وظيفتهم على التغيرات تشكيلية مدفوعة تحليل هيدروليسيس ATP وملزمة مع البروتينات العميل بوساطة المرافقين المشاركين2. على الرغم من الإمكانات الواضحة ل Hsp90 كهدف علاجي ، فإن ضبط وظيفته يمثل تحديا كبيرا. هناك العديد من مثبطات Hsp90 التي تستهدف منطقة ربط ATP N-terminal ، والتي تم تقييمها في التجارب السريرية ، ولكن لم تتم الموافقة على أي منها للتسويق3. نظرا لعدم وجود جيب ملزم ليغاند محددة جيدا4، واستهداف منطقة C-محطة Hsp90 كان نجاحا محدودا4. في الآونة الأخيرة ، تم التحقيق في تعطيل تفاعلات Hsp90-cochaperone بواسطة جزيئات صغيرة كاستراتيجية بديلة5. استهداف التفاعلات Hsp90-cochaperone لن تثير استجابة الإجهاد الخلية العامة ويوفر إمكانية لتنظيم العمليات داخل الخلايا على وجه التحديد. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية الترغيببتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين6. من 736 TPR البروتينات التي تحتوي على عزر المشروح في قاعدة بيانات البروتين البشري، ~ 20 البروتينات المختلفة تتفاعل مع Hsp90 عبر هذا الببتيد7. الجزيئات المتنافسة على MEEVD الببتيد ملزمة من شأنه أن يعطل التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين التي تحتوي على مجال TPR. يحتوي موقع ربط الببتيد على بنية ثالثة مماثلة ولكن التماثل العام بين نطاقات عزر TPR المختلفة منخفض نسبيا7، مما يوفر فرصة لتحديد الجزيئات القادرة على منع التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين في TPR-motif. من بين هذه TPR عزر المرافقين المشاركين, FK506 ملزمة البروتين (FKBP) 51 و FKBP52 هي المنظمين لمستقبلات هرمون الستيرويد (SHR) الإشارات والمشاركة في العديد من الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد بما في ذلك السرطان, الأمراض المرتبطة بالإجهاد, أمراض التمثيل الغذائي, ومرض الزهايمر8. على الرغم من أن FKBP51 و FKBP52 يشتركان > تشابه تسلسلي بنسبة 80٪، إلا أن وظائفهما تختلف: FKBP52 هو منظم إيجابي لنشاط SHR، في حين أن FKBP51 هو منظم سلبي في معظم الحالات8. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات ، على وجه التحديد منع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 ، يوفر إمكانات علاجية واعدة للأمراض ذات الصلة.
تمتطوير Luminescent Proximity Homogenous A ssay(AlphaScreen) لأول مرة في عام 1994 من قبل أولمان EF وآخرون. الآن يتم استخدامه على نطاق واسع للكشف عن أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية، مثل الببتيد10،البروتين11،الحمض النووي12،RNA13،والسكر14. في هذه التقنية، هناك نوعان من الخرز (قطرها 200 نانومتر)، واحد هو حبة المانحة والآخر هو حبة المقبول. يتم شل الجزيئات الحيوية على هذه الخرز؛ تفاعلاتها البيولوجية تجلب الخرز المانحة والمقبل في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. لأن الأكسجين المفرد له عمر قصير ، فإنه يمكن أن ينتشر فقط حتى 200 نانومتر. إذا كان حبة المقبول على مقربة، مشتق ثيوكسيني يتفاعل مع الأكسجين المفرد توليد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها ضوء في 520-620 نانومتر15. إذا تعطلت التفاعلات البيولوجية ، لا يمكن أن تصل حبة المقبول وخرزة المتبرع إلى القرب ، مما يؤدي إلى تسوس الأكسجين المفرد والإشارة المنخفضة المنتجة.
هنا نحن نصف بروتوكول باستخدام هذه التقنية لفحص جزيئات صغيرة تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR المرافقين المشاركين، وخاصة FKBP51 و FKBP52. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لHsp90 المدقع C-terminus إلى حبات acceptor. يتفاعل المرافقون المشاركون في TPR الموسومون ب GST المنقى مع حبات المتبرعين المرتبطة بالجلوتاثيون. عندما التفاعل بين الببتيدات Hsp90 المشتقة وتي بي آر عزر المرافقين المشارك يجمع الخرز معا، يتم إنتاج إشارة مكبرة(الشكل 1A). إذا كانت الجزيئات الصغيرة التي تم فحصها يمكن أن تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين، سيتم تقليل هذه الإشارة مكبرة(الشكل 1B). ويمكن حساب IC50 من خلال القياس الكمي. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أي مرافق - تفاعلات مرافق مشارك في TPR-motif ذات أهمية كبيرة في تطوير جزيئات جديدة ، مما يمنع على وجه التحديد التفاعل بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> الشكل 1:المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. (أ) تنقية GST-FKBP51 يتفاعل مع حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لC-terminus المتطرفة من Hsp90 إلى حبات acceptor. التفاعل بين الببتيدات المشتقة من Hsp90 ومجال TPR من FKBP51 يجعل المتبرع والخرز المقبول في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. مشتق الثيوكسيني على حبة المقبول يتفاعل مع الأكسجين المفرد ويولد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها الضوء في 520-620 نانومتر. (ب)عندما تمنع الجزيئات الصغيرة التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 ، لا يمكن للخرز المانح والمقبل الوصول إلى القرب. ثم الأكسجين المفرد مع تسوس العمر القصير ، ولا يتم إنتاج إشارة يمكن اكتشافها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

استهداف بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) - التفاعلات cochaperone يوفر إمكانية لتنظيم العمليات على وجه التحديد Hsp90 تعتمد داخل الخلايا. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية التريتريكبتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين. بروتين FK506 ملزمة (FKBP) 51 و FKBP52 هما مماثلة TPR عزر المرافقين المشاركين المشاركين في الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد مع وظائف مختلفة. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 يوفر إمكانات علاجية واعدة للعديد من الأمراض البشرية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتضخيم القرب الإنارة المقايسة متجانسة للتحقيق التفاعلات بين Hsp90 وشريكها المرافقين FKBP51 و FKBP52. أولا، قمنا بتنقية البروتينات المحتوية على TPR FKBP51 و FKBP52 في شكل الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسومة. باستخدام حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون مع البروتينات TPR-عزر GST تنصهر والخرز مقبول إلى جانب 10 مير C-محطة الببتيد من Hsp90, لقد بحثت التفاعلات البروتين البروتين في بيئة متجانسة. لقد استخدمنا هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

في المقايسة لدينا، عامل Z ونسبة S/ B هي 0.82 و 13.35، على التوالي(الشكل 3A)،مما يدل على أن لدينا المقايسة قوية وموثوق بها لفحص عالية الإنتاجية. ثم استخدمناه لفحص المركبات الجزيئية الصغيرة. الشكل 3B يقدم تثبيط تعتمد على الجرعة من التفاعلات المرافقين-cochaperone مع جزيء صغ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

بنينا مقاما متجانسا قائما على الخرز لدراسة التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون. باستخدام هذه التقنية، نقوم بفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKDP51 أو FKBP52 وتحديد مثبطات قوية وانتقائية. تقنية الفحص عالية الإنتاجية هذه قوية وموثوقة.يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، ويتطلب سوى كميات صغيرة من بروتين الخرز والمركبات. وكان التفاعل Hsp90 مع هذا cochaperones متورطة في اضطرابات بشرية، مثل مرض الزهايمر والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. توفر هذه التقنية الفرصة لفحص مثبطات مرافق الكوشابيرون ذات الأهمية الطبية العالية.وهنا المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. عندما التفاعل بين Hsp90C-محطة الببتيد وتي بي آر المجال من cochaperones يجلب المانح والخرز المقبول في القرب، يتم إنشاء إشارة تضخيم للغاية. عند إضافة مثبطات التفاعل، لا يمكن للمانح والخرز المقبول الوصول إلى القرب، ولا يتم إنتاج أي إشارة يمكن اكتشافها.تبدأ بتخفيف الببتيد Hsp90 في برنامج تلفزيوني في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر. تمييع الخرز المقبول غير المترافق في PBS ، ونقل الخرز إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. طرد مركزي الخرز المخفف لغسل، ومن ثم إزالة بعناية supernatant.للترافق، تعيين حبات المقبول في الببتيدات بنسبة 10 إلى 1. إلى حبات paletide في برنامج تلفزيوني الببتيد المخفف، توين 20 والصوديوم cyanaboroughhydride الحل، واحتضان مع نهاية على نهاية التحريض على شاكر دوارة. لمنع المواقع غير المنقحة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول واحد الأضراس تريس هيدروكلوريد من درجة الحموضة 8.0 إلى الخرز، وإرواء رد الفعل عن طريق احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، اغسل الخرز عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخرز في ملليلتر واحد من محلول ثلاثي هيدروكلوريد. كرر الغسيل مرتين أخريين. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخرز في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر في المخزن المؤقت وتخزين حل حبة المقبول المترافق في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.إضافة حبات المانحة الجلوتاثيون في 10 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في برنامج تلفزيوني. أضف GSTFKBP51 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان التفاعل لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. جعل التخفيفات التسلسلية من مركب الاختبار في DMSO.إضافة 0.25 ميكرولتر من تخفيف مركب الاختبار وثلاثة أمثال في زاوية كل بئر من لوحة بئر 384. للتحكم السلبي، أضف 0.25 ميكرولتر من DMSO وللتحكم الإيجابي، أضف 0.25 ميكرولتر من الببتيد Hsp90 C-Terminal في الآبار. إضافة 22.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على حبات المانحة الجلوتاثيون مع البروتينات الموسومة GST إلى كل بئر.يهز لوحة جيدا مع اليدين واحتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمييع حبات المقبول مع الببتيد Hsp90C-Terminal المرفق إلى 100 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في 0.5 مرة PBS. إضافة 2.25 ميكرولتر من حبات المقبول المخفف إلى كل بئر.يهز واحتضان لوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة كما هو موضح. قم بتشغيل أداة قارئ اللوحة، و قم بقياس إشارة اللوحة و قم بتحليل البيانات كما هو موضح في مخطوطة النص. إنشاء جدول بيانات س ص في الحوار الترحيب، حدد أرقام س، ص وأدخل ثلاث قيم النسخ المتماثل في الأعمدة جنبا إلى جنب.استيراد قيم التركيز إلى العمود X وقيم الإشارة إلى العمود ص. انقر فوق تحليل، وحدد تحويل التركيز X، ثم حدد تحويل إلى لوغاريتمات. انقر فوق تحليل واختيار الانحدار غير الخطي ضمن تحليل س ص.فتح خيار تثبيط استجابة الجرعة واختيار سجل مقابل استجابة متغير المنحدر المعادلة. انقر فوق موافق لعرض النتائج التي تحتوي على قيمة IC50 والرسوم البيانية. تم استخدام هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة ، مما يمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.درجة Z من أكثر من 0.8 ونسبة الإشارة إلى الخلفية من 13.35، تثبت قوة وموثوقية لفحص الإنتاجية العالية. تم تقييم تأثير مركب اختبار الوزن الجزيئي الصغير D10 على تثبيط التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون وتم حساب قيم IC50 ، حيث أظهرت D10 تثبيطا يعتمد على الجرعة. كانت قيمة IC50 لتفاعلات Hsp90 GSTFKBP51 65 نانومولار.في حين أن لHsp90، GSTFKBP52 التفاعلات، لم يتحقق تثبيط كامل مع تركيز أعلى مركب يشير إلى أنه يمكن تحقيق تثبيط انتقائي للتفاعل البروتين البروتين مع جزيئات صغيرة. والخطوة الحاسمة هي ترتيب الإضافة. نحن أول تشكيل مجمع بين جزيء صغير وهدفه TPR.وإلا فإن الحضانة الأطول وتركيزات المركب الأعلى مطلوبة. يمكننا استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعطل التفاعل بين Hsp90 و FKB51 أو Hsp90 و FKB52. ويمكن أيضا أن تمتد إلى أي تفاعل بين Hsp90, Hsp70 و عزر TPR التي تحتوي على مثبطات فحص الكوشابيروني الانتقائية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...