Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
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这项研究得到了瑞典研究理事会（2018-02843）、大脑基金会（Fo 2019-0140）、卡罗林斯卡研究所老年病基金会、冈沃和约瑟夫·阿尼尔斯基金会、马格努斯·伯格瓦尔斯基金会、冈和伯蒂尔·斯托恩斯基金会、托雷·尼尔森医学研究基金会、玛格丽特·阿夫·乌格拉斯基金会和老仆人基金会的资助。

注：此协议概述显示在 图 2中。
1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达和净化 （图 2A）
<ol><li>
质 粒 注：从图像联盟获取用于人类FKBP51（克隆 ID：5723416）和用于人类 FKBP52（克隆 ID：7474554）的 cDNA 克隆。<ol>
<li>用引物放大人类 Fkbp51 Dna （前进; 5 'Ggatccatactactgaggt - 3'， 反向; 5 '- CTCGCTCTCTCCAC - 3'）， 包含巴姆希和 Xhoi 悬垂， 克...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. 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F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

在这里，我们描述了一个协议，使用检测筛选小分子抑制Hsp90和TPR-motif共同伴奏之间的相互作用，特别是FKBP51和FKBP52。其高 Z 分数（>0.8）显示了高通量格式的坚固性和可靠性。结果可以在一小时内获得，需要少量的珠子、蛋白质和化合物。此外，此协议可以轻松扩展到任何 Hsp90/Hsp70 - TPR-主题共同伴奏感兴趣的相互作用。Hsp90 的几个 TPR-motif 共同伴奏与各种人类疾病有牵连，从阿尔茨海默氏症到自?...

分子伴奏有助于蛋白质平衡，包括蛋白质折叠、运输和降解。它们调节几个细胞过程，与许多疾病有关，如癌症和神经退行性疾病1。热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的伴奏之一，其功能取决于ATP水解驱动的构象变化，并与由其共同伴奏2调解的客户蛋白结合。尽管Hsp90作为治疗靶点的潜力显而易见，但微调其功能是一个很大的挑战。有几个Hsp90抑制剂针对N终端ATP结合区，已在临床试验中评估，但没有一个已被批准营销3。由于缺乏一个明确的配体绑定口袋4，针对Hsp90的C终端区域已经取得了有限的成功4。最近，小分子对Hsp90-cochaperone相互作用的破坏被作为替代策略5进行了研究。以Hsp90-cochaperone相互作用为目标不会引起一般细胞应激反应，并有可能具体调节各种细胞内过程。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共伴6的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。在人类蛋白质数据库中注释的736种TPR主题含图案的蛋白质中，有20种不同的蛋白质通过这种肽7与Hsp90相互作用。分子争夺MEEVD肽结合会破坏Hsp90和含有TPR域的共同伴奏之间的相互作用。肽结合场具有类似的第三级结构，但不同TPR主题域之间的整体同源性相对较低，提供了一个机会来识别分子，特别是能够阻止Hsp90和特定TPR-主题共同伴奏之间的相互作用。在这些TPR-motif共同伴奏中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号的调节器，并涉及多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、压力相关疾病、代谢疾病和阿尔茨海默氏症8。虽然FKBP51和FKBP52的份额>80%的序列相似性，但它们的功能不同：FKBP52是SHR活动的正调节器，而FKBP51在大多数情况下是负监管机构。因此，识别分子，特别是阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用，为相关疾病提供了有希望的治疗潜力。
1994年，乌尔曼EF等人首次研制出一种Mpl化L微生P生源性Asay（阿尔法屏幕）。现在，它被广泛用于检测不同类型的生物相互作用，如肽10，蛋白质11，DNA12，RNA13和糖14。在这项技术中，有两种珠子（直径200纳米），一种是捐赠珠，另一种是接受珠。生物分子固定在这些珠子上;他们的生物相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。由于单氧寿命短，只能扩散至200纳米。如果接受珠在附近，其硫氧生成物与在370纳米下产生化疗的单氧发生反应。这种能量进一步激活荧光灯在同一接受珠发出光在520-620纳米15。如果生物相互作用中断，接受珠和供体珠无法接近，导致单氧衰变和低生成信号。
在这里，我们描述了使用这种技术筛选小分子，抑制Hsp90和TPR共同伴奏之间的相互作用的协议，特别是FKBP51和FKBP52。与Hsp90极端C终点站对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。纯化 Gst 标记的 Tpr 共同伴奏与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。当Hsp90衍生肽和TPR-motif共同伴奏器之间的相互作用将珠子聚集在一起时，就会产生放大信号（图1A）。如果筛选的小分子可以抑制Hsp90和TPR-主题共同伴奏之间的相互作用，这个放大的信号将减少（图1B）。他们的IC50 可以通过定量测量来计算。此协议可以扩展到任何伴奏 - TPR-motif 共同伴奏相互作用的兴趣，并在新分子的发展中非常重要，特别是阻止Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> 图1：本检测的基本原则。（A） 纯化GST-FKBP51与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。与Hsp90极端C终点相对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。Hsp90 衍生肽和 FKBP51 的 TPR 域之间的相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。接受珠上的硫化物衍生物与单氧发生反应，在 370 nm 处产生化疗。这种能量进一步激活同一接收珠中的荧光，以 520-620 nm 发射光。（B） 当小分子抑制Hsp90和FKBP51之间的相互作用时，供体和接受珠无法接近。然后，寿命短的单氧衰变，并且不产生可检测的信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

针对热休克蛋白 90 （Hsp90） - 可可酮相互作用提供了专门调节 Hsp90 依赖细胞内过程的可能性。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共护的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。FK506 结合蛋白 （FKBP） 51 和 FKBP52 是两个类似的 TPR 主题共同伴奏涉及类固醇激素依赖性疾病具有不同的功能.因此，识别专门阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间相互作用的分子为几种人类疾病提供了有希望的治疗潜力。在这里，我们描述了放大发光接近同质测定程序，以调查Hsp90与其合作伙伴FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们以谷胱甘肽S转移酶（GST）标记形式纯化了含TPR图案的蛋白质FKBP51和FKBP52。利用与谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 蛋白和接受珠，以及 Hsp90 的 10 mer C 终端肽，我们探索了同质环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。我们利用此检测屏蔽小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。

在我们的测定中，Z'因子和S/B比率分别为0.82和13.35（图3A），表明我们的测定对于高通量筛选是可靠可靠的。然后，我们用它来筛选小分子质量化合物。 图3B 对伴奏-协茶酮与选定小分子（D10）的相互作用呈现剂量依赖抑制。D10 的剂量响应曲线由非线性回归分析生成，根据该分析计算 IC50 值。D10 显示剂量依赖抑制在 Hsp90 - GST-FKBP51 和 Hsp90 - GST-FKB...

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Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

该协议提出了一种利用谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 共同伴奏和接受珠以及 Hsp90 衍生肽来探索蛋白质- 蛋白质相互作用的技术。我们使用此技术筛选小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。

使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

我们建立了一个同质的基于珠子的检测来研究伴奏-科查佩龙的相互作用。使用此技术，我们筛选抑制 Hsp90 和 FKDP51 或 FKBP52 之间相互作用的小分子，并识别有效和选择性的抑制剂。这种高通量筛选技术是强大和可靠的。结果可以在一小时内获得，它只需要少量的珠子蛋白和化合物。Hsp90 与这种共茶酮的相互作用与人类疾病有关， 如阿尔茨海默氏症， 癌症， 自身免疫性疾病.该技术提供了筛选具有高度医学重要性的伴郎-可可酮抑制剂的机会。以下是此检测的基本原则。当 Hsp90C-终端肽和可可酮 TPR 域之间的相互作用使供体和接受者珠子接近时，就会生成高度放大的信号。添加相互作用抑制剂时，供体和接受珠无法接近，也不会产生可检测信号。首先以每毫升浓度一毫克稀释PBS中的Hsp90肽。稀释 PBS 中未合并的接受珠，并将珠子转移到 1.5 毫升管中。将稀释的珠子离心清洗，然后小心地取出超高那。对于结合，将接受珠设定为肽中的接受珠，比例为 10 比 1。对PBS稀释肽、Tween 20和氰化钠溶液中的古肽珠，在旋转摇床上孵育末端搅拌。为了阻挡未激活的部位，在珠子中加入20微升pH 8.0的盐酸摩尔三酯溶液，并在37摄氏度下孵育一小时，以抑制反应。在孵化结束时，通过离心清洗珠子，并将珠粒重新悬浮在一毫升盐酸三酯溶液中。再重复洗两次。最后一次洗涤后，将珠子以每毫升浓度一毫克重新悬挂在存储缓冲器中，并将结合的接受珠溶液存放在 4 摄氏度的光线下。在 PBS 中加入谷胱甘肽捐赠者珠，每毫升浓度为 10 微克。将 GSTFKBP51 添加到每毫升 10 微克的最终浓度中，并在黑暗中在 25 摄氏度下孵育反应 10 分钟。对 DMSO 中的测试化合物进行串行稀释。在 384 井板的每口井的一角加入 0.25 微升的测试复合稀释剂和三重。对于负控制，在井中加入0.25微升DMSO和正控制，在井中加入0.25微升Hsp90 C-终端肽。在每口油井中加入含有谷胱甘肽供体珠的22.5微升含有GST标记蛋白的溶液。用手彻底摇动盘子，在25摄氏度的黑暗中孵育15分钟。将附着的 Hsp90C-终端肽稀释接收珠，每毫升浓度为 100 微克，是 PBS 的 0.5 倍。在每口井中加入2.25微升稀释的接受珠。如前所示，在黑暗中摇动并孵育盘子15分钟。打开板读取器仪器，测量板的信号并分析文本手稿中描述的数据。在欢迎对话中创建 X-Y 数据表，选择 X 数字、Y 并在并排列中输入三个复制值。将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。单击分析，选择转换浓度 X，然后选择转换为对数。单击 X-Y 分析下的单击分析并选择非线性回归。打开剂量响应抑制选项，选择日志与响应可变坡度方程。单击"可以"查看包含 IC50 值和图形的结果。此检测用于筛选小分子，抑制 Hsp90 和 FKBP51 或 FKBP52 之间的相互作用。Z 分数超过 0.8，信号与背景比为 13.35，显示了高吞吐量筛选的稳健性和可靠性。小分子量测试化合物D10对伴奏-协茶酮相互作用的抑制作用进行了评估，并计算了IC50值，其中D10显示剂量依赖抑制。Hsp90 GSTFKBP51 相互作用的 IC50 值为 65 纳米摩尔。而对于Hsp90，GSTFKBP52相互作用，完全抑制没有达到最高的化合物浓度表明，蛋白质与小分子相互作用的选择性抑制可以实现。关键步骤是添加顺序。我们首先在小分子和TPR目标之间形成一个复合体。否则需要更长的孵化和更高的复合浓度。我们可以使用这种技术来筛选破坏Hsp90和FKB51或Hsp90和FKB52之间的相互作用的小分子。它也可以扩展到 Hsp90， Hsp70 和包含可可龙筛选选择性抑制剂的 TPR 主题之间的任何相互作用。

Research

JoVE Journal

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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科研

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Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角度 x 射线散射溶液中大分子的结构研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...