Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio svedese della ricerca (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases presso Karolinska Institutet, Gunvor and Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun and Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medical research, Margaretha af Ugglas foundation e Foundation for Old Servants.

NOTA: una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2.
1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)
<ol><li>
Plasmidi NOTA: Ottenere cDNA cloni per FKBP51 umano (id clone: 5723416) e per FKBP52 umano (id clone: 7474554) dal consorzio IMAGE.<ol>
<li>Amplificare il DNA umano FKBP51 mediante PCR con primer (in avanti; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTT...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

Qui descriviamo un protocollo che utilizza il test per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. Il suo punteggio Z' elevato (>0,8) dimostra la robustezza e l'affidabilità per un formato ad alto throughput. I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e sono necessarie piccole quantità di perle, proteine e composti. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere facilmente esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone Hsp90/Hsp70 - TP...

Gli chaperoni molecolari contribuiscono all'omeostasi delle proteine, compreso il ripiegamento, il trasporto e la degradazione delle proteine. Regolano diversi processi cellulari e sono legati a numerose malattie come il cancro e le malattie neurodegenerative1. Heat shock protein 90 (Hsp90) è uno dei più importanti chaperoni la cui funzione dipende dai cambiamenti conformazionali guidati dall'idrolisi dell'ATP e dal legame con le proteine client mediate dai suoi co-chaperoni2. Nonostante un evidente potenziale di Hsp90 come bersaglio terapeutico, la messa a punto della sua funzione rappresenta una grande sfida. Esistono diversi inibitori di Hsp90 che prendono di mira la regione di legame con l'ATP N-terminale, che sono stati valutati in studi clinici, ma nessuno di essi è stato approvato per lacommercializzazione 3. A causa della mancanza di una tasca legante bendefinita 4, mirata alla regione C-terminale di Hsp90 ha avuto un successo limitato4. Recentemente, l'interruzione delle interazioni Hsp90-cochaperone da parte di piccole molecole è stata studiata come strategia alternativa5. Il targeting delle interazioni Hsp90-cochaperone non susciterebbe una risposta generale allo stress cellulare e offre la possibilità di regolare specificamente vari processi intracellulari. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni6. Delle 736 proteine contenenti motivi TPR annotate nel database delle proteine umane, ~ 20 diverse proteine interagiscono con Hsp90 tramite questo peptide7. Le molecole che competono per il legame peptidico MEEVD interromperebbero le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni contenenti un dominio TPR. Il sito di legame peptidico ha una struttura terziaria simile, ma l'omologia complessiva tra diversi domini del motivo TPR è relativamente bassa7, fornendo l'opportunità di identificare molecole specificamente in grado di bloccare le interazioni tra Hsp90 e particolari co-chaperoni del motivo TPR. Tra questi co-chaperoni del motivo TPR, la proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono regolatori della segnalazione del recettore dell'ormone steroideo (SHR) e coinvolti in diverse malattie steroidee ormono-dipendenti tra cui cancro, malattie legate allo stress, malattie metaboliche e morbo di Alzheimer8. Sebbene FKBP51 e FKBP52 condividano > somiglianza di sequenza dell'80%, le loro funzioni differiscono: FKBP52 è un regolatore positivo dell'attività SHR, mentre FKBP51 è un regolatore negativo nella maggior parte dei casi8. Pertanto, l'identificazione delle molecole, bloccando in particolare le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52, fornisce un potenziale terapeutico promettente per le malattie correlate.
Unsaggio Luminescente Pomogeno A(AlphaScreen) è stato sviluppato per la prima volta nel 1994 da Ullman EF et al.9. Ora è ampiamente usato per rilevare diversi tipi di interazioni biologiche, come il peptide10, la proteina11, il DNA12, l'RNA13e lo zucchero14. In questa tecnica, ci sono due tipi di perle (diametro 200 nm), una è la perle donatrice e l'altra è la perle accettore. Le biomolecole sono immobilizzate su queste perle; le loro interazioni biologiche portano le perle del donatore e dell'accettore nelle vicinanze. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Poiché l'ossigeno singoletto ha una vita breve, può diffondersi solo fino a 200 nm. Se il perle accettore è in prossimità, il suo derivato tiosseno reagisce con l'ossigeno singoletto generando chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm15. Se le interazioni biologiche vengono interrotte, il perno accettore e il perno donatore non possono raggiungere la vicinanza, con conseguente decadimento dell'ossigeno singoletto e segnale basso prodotto.
Qui descriviamo un protocollo che utilizza questa tecnica per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti a Hsp90 estremo C-terminus sono attaccati a perline accettori. I co-chaperoni TPR purificati con tag GST interagiscono con le perle di donatore legate al glutatione. Quando l'interazione tra peptidi derivati da Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR riunisce le perle, viene prodotto un segnale amplificato (Figura 1A). Se le piccole molecole schermate possono inibire le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR, questo segnale amplificato sarà diminuito (Figura 1B). Il loro IC50 può essere calcolato mediante misurazione quantitativa. Questo protocollo può essere esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone chaperone chaperone - TPR-motif ed è di grande importanza nello sviluppo di nuove molecole, bloccando in particolare l'interazione tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> Figura 1: Il principio di base di questo saggio. (A) GST-FKBP51 purificato interagisce con le perle donatrici legate al glutatione. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti all'estremo C-terminus di Hsp90 sono attaccati alle perle accettori. L'interazione tra i peptidi derivati da Hsp90 e il dominio TPR di FKBP51 porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Il derivato tiossene sul perle accettore reagisce con l'ossigeno singoletto e genera chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm. (B) Quando piccole molecole inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKBP51, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità. Quindi l'ossigeno singoletto con breve durata decade e non viene prodotto alcun segnale rilevabile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

Il targeting delle interazioni con la proteina 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilità di regolare specificamente i processi intracellulari Hsp90-dipendenti. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni. La proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono due co-chaperoni simili con motivo TPR coinvolti in malattie steroidee ormono-dipendenti con funzioni diverse. Pertanto, l'identificazione di molecole che bloccano specificamente le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52 fornisce un potenziale terapeutico promettente per diverse malattie umane. Qui, descriviamo il protocollo per un saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato per sondare le interazioni tra Hsp90 e i suoi co-accompagnatori partner FKBP51 e FKBP52. In primo luogo, abbiamo purificato le proteine contenenti il motivo TPR FKBP51 e FKBP52 in forma di glutatione S-transferasi (GST). Utilizzando le perle donatrici legate al glutatione con proteine TPR-motif fuse GST e le perle accettori accoppiate con un peptide C-terminale 10 mer di Hsp90, abbiamo sondato le interazioni proteina-proteina in un ambiente omogeneo. Abbiamo utilizzato questo test per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Nel nostro test, il fattore Z e il rapporto S/B sono rispettivamente 0,82 e 13,35 (Figura 3A), dimostrando che il nostro test è robusto e affidabile per lo screening ad alto rendimento. L'abbiamo quindi usato per lo screening di piccoli composti di massa molecolare. La Figura 3B presenta l'inibizione dose-dipendente delle interazioni chaperone-cochaperone con una piccola molecola selezionata (D10). Le curve dose-risposta per D10 sono generate dall'analisi di re...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Abbiamo costruito un test omogeneo basato su perle per studiare le interazioni chaperone-cochaperone. Usando questa tecnica, vastiamo a screening piccole molecole che inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKDP51 o FKBP52 e identifichiamo inibitori potenti e selettivi. Questa tecnica di screening ad alta produttività è robusta e affidabile.I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e richiede solo piccole quantità di proteine e composti di perle. L'interazione di Hsp90 con questi cochaperones è stata implicata in disturbi umani, come il morbo di Alzheimer, il cancro, la malattia autoimmune. Questa tecnica offre l'opportunità di schermare gli inibitori chaperone-cochaperone con elevata importanza medica.Ecco il principio di base di questo test. Quando l'interazione tra il peptide Hsp90C-terminale e il dominio TPR dei cochaperones porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità, viene generato un segnale altamente amplificato. Quando vengono aggiunti gli inibitori dell'interazione, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità e non viene prodotto alcun segnale rilevabile.Iniziare diluendo il peptide Hsp90 in PBS a una concentrazione di milligrammo per millilitro. Diluire le perle accettori non coniugate in PBS e trasferire le perle in un tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare le perle diluite per il lavaggio, quindi rimuovere con cura il surnatante.Per coniugare, impostare le perle accettori in peptidi in un rapporto di 10 a 1. Alle perle paletidiche al peptide diluito PBS, alla soluzione di Tween 20 e sodio cyanaboroughhydride e incubare con agitazione end over end su uno shaker rotativo. Per bloccare i siti non reazionati, aggiungere 20 microlitri di una soluzione molare di Tris cloridrato di pH 8,0 alle perline e spegnere la reazione incubando per un'ora a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le perle mediante centrifugazione e sospendere di sospendere il pellet di perle in un millilitro di soluzione di tris cloridrato. Ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di sospendere le perle a una concentrazione di milligrammi per millilitro nel tampone di stoccaggio e conservare la soluzione di perle accettore coniugata a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce.Aggiungere pere donatrici di glutatione a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS. Aggiungere GSTFKBP51 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare la reazione per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Effettuare diluizioni seriali del composto di prova in DMSO.Aggiungere 0,25 microlitri di diluizioni composte di prova e triplicare nell'angolo di ciascun pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Per il controllo negativo, aggiungere 0,25 microlitri di DMSO e per il controllo positivo, aggiungere 0,25 microlitri di peptide Hsp90 C-Terminal nei pozzetti. Aggiungere 22,5 microlitri della soluzione contenente pere donatrici di glutatione con proteine marcate GST a ciascun pozzo.Agitare accuratamente il piatto con le mani e incubare al buio a 25 gradi Celsius per 15 minuti. Diluire le perle accettori con il peptide Hsp90C-terminale collegato a 100 microgrammi per millilitro di concentrazione in 0,5 volte PBS. Aggiungere 2,25 microlitri di perle accettori diluite a ciascun pozzo.Agitare e incubare la piastra al buio per 15 minuti come dimostrato. Accendere lo strumento del lettore di lastre, misurare il segnale della piastra e analizzare i dati come descritto nel manoscritto di testo. Creare una tabella dati X-Y nella finestra di dialogo di benvenuto, selezionare Numeri X, Y e immettere tre valori di replica nelle colonne affiancate.Importare i valori di concentrazione nella colonna X e i valori del segnale nella colonna Y. Fare clic su Analizza, selezionare Trasforma concentrazione X, quindi selezionare Trasforma in logaritmi. Fare clic su Analizza e scegliere regressione non lineare in Analisi X-Y.Aprire l'opzione di inibizione della risposta alla dose e scegliere l'equazione della pendenza variabile log versus response. Fare clic su OK per visualizzare i risultati contenenti il valore IC50 e i grafici. Questo test è stato utilizzato per lo screening di piccole molecole, inibendo le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.Il punteggio Z superiore a 0,8 e il rapporto segnale/background di 13,35 dimostrano la robustezza e l'affidabilità per uno screening ad alto throughput. È stato valutato l'effetto del composto di prova di piccolo peso molecolare D10 sull'inibizione delle interazioni chaperone-cochaperone e sono stati calcolati i valori IC50, dove D10 ha mostrato un'inibizione dose-dipendente. Il valore IC50 per le interazioni Hsp90 GSTFKBP51 era di 65 nanomolari.Mentre per le interazioni Hsp90, GSTFKBP52, l'inibizione completa non è stata raggiunta con la più alta concentrazione di composti indica che è possibile ottenere l'inibizione selettiva dell'interazione proteina-proteina con piccole molecole. Il passo critico è l'ordine di aggiunta. Per prima cosa formiamo un complesso tra una piccola molecola e il suo bersaglio TPR.Altrimenti sono necessarie un'incubazione più lunga e concentrazioni di composti più elevate. Possiamo usare questa tecnica per lo screening di piccole molecole che interrompono l'interazione tra Hsp90 e FKB51 o Hsp90 e FKB52. Può anche essere esteso a qualsiasi interazione tra Hsp90, Hsp70 e un motivo TPR contenente inibitori selettivi dello screening del cochaperone.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...