Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

この研究は、スウェーデン研究評議会(2018-02843)、ブレイン財団(Fo 2019-0140)、カロリンスカ研究所、ガンバーとヨーゼフ・アノール財団、マグヌス・ベルクヴァルス財団、ガンとベルティル・ストーネス財団、トレ・ニルソンズ医学研究財団、トレ・ニルソンズ財団からの助成金によって支えられました。

注 : このプロトコルの概要を 図 2に示します。
1. GST-FKBP51およびGST-FKBP52の発現と精製 (図2A)
<ol><li>
プラスミド 注:画像コンソーシアムから、ヒトFKBP51(クローンID:5723416)およびヒトFKBP52(クローンID:7474554)のcDNAクローンを取得します。<ol>
<li>バミヒとXhoI制限部位でpGEX6-1ベクターにオーバーハングし、クローンを含...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

ここでは、Hsp90とTPR-モチーフコシャペロン、特にFKBP51およびFKBP52との相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのアッセイを用いたプロトコルについて説明する。高いZ'スコア(>0.8)は、ハイスループット形式の堅牢性と信頼性を示しています。結果は1時間以内に得ることができ、少量のビーズ、タンパク質および化合物が必要とされる。さらに、このプロトコルは、関心のある任?...

分子シャペロンは、タンパク質のフォールディング、輸送、分解など、タンパク質ホメオスタシスに寄与します。彼らはいくつかの細胞プロセスを調節し、癌や神経変性疾患などの多数の疾患にリンクされています1.ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、その機能がATP加水分解によって駆動される立体構造変化に依存し、その共シャペロン2によって媒介されるクライアントタンパク質と結合する最も重要なシャペロンの1つである。治療目標としてHsp90の明らかな可能性にもかかわらず、その機能を微調整する大きな課題を表しています。N末端ATP結合領域を標的としたいくつかのHsp90阻害剤は臨床試験で評価されているが、いずれもマーケティングのために承認されていない3。明確に定義されたリガンド結合ポケット4の欠如のために、Hsp90のC末端領域を標的にすることは、限られた成功を持っていた4.近年、低分子によるHsp90-コカペロン相互作用の破壊が代替戦略5として検討されている。Hsp90-コカペロン相互作用を標的とすることは、一般的な細胞ストレス応答を引き出すものではなく、細胞内プロセスを特異的に調節する可能性を提供する。Hsp90のC末流で保存されたMEEVDペンタペプチドは、コシャペロン6のテトラトリコペプチド反復(TPR)モチーフとの相互作用を担う。ヒトタンパク質データベースにアポイントトされた736 TPRモチーフ含有タンパク質のうち、〜20種類の異なるタンパク質がこのペプチド7を介してHsp90と相互作用する。MEEVDペプチド結合を競合する分子は、TPRドメインを含むHsp90とコシャペロンとの相互作用を破壊するであろう。ペプチド結合部位は類似した三次構造を有するが、異なるTPRモチーフドメイン間の全体的な相同性は比較的低い7であり、Hsp90と特定のTPR-モチーフコシャペロンとの間の相互作用を特異的に遮断し得る分子を同定する機会を提供する。これらのTPR-モチーフコシャペロンの中でも、FK506結合タンパク質(FKBP)51およびFKBP52は、ステロイドホルモン受容体(SHR)シグナル伝達の調節因子であり、癌、ストレス関連疾患、代謝性疾患、およびアルツハイマー病8を含むいくつかのステロイドホルモン依存性疾患に関与する。FKBP51とFKBP52は80%の配列類似性>共有するが、それらの機能は異なる:FKBP52はSHR活性の肯定的な調節因子であり、FKBP51はほとんどの場合8において負の調節因子である。したがって、分子を同定し、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との間の相互作用を特異的に遮断し、関連疾患に有望な治療可能性を提供する。
Mplified Luminescent PロキシミティH眼用Assay(アルファスクリーン)は、1994年にウルマンEFららによって最初に開発されました。現在では、ペプチド10、タンパク質11、DNA12、RNA13、糖14など、さまざまな種類の生物学的相互作用を検出するために広く使用されています。この技術では、ビーズの2種類(直径200nm)があり、一方がドナービーズ、もう1つがアクピコンドールビーズである。生体分子はこれらのビーズに固定化されています。彼らの生物学的相互作用は、ドナーとアクセクタービーズを近接させる。680 nmでは、ドナービーズの光化剤が酸素を点灯し、酸素を単一酸素に変換します。単一酸素は寿命が短いため、最大200nmまで拡散することしかできません。アクセクサビーズが近接している場合、そのチオキセン誘導体は、370nmで化学発光を生成する単一の酸素と反応する。このエネルギーは、520-620 nm15で発光する同じアクセプタビーズ内の蛍光体をさらに活性化する。生物学的相互作用が中断された場合、アクセプタービーズとドナービーズは近接に達することができず、その結果、単一の酸素崩壊および低生成信号が生じる。
ここでは、Hsp90とTPRコシャペロン、特にFKBP51およびFKBP52との相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのこの技術を用いたプロトコルについて説明する。Hsp90極限C末端に対応する10アミノ酸長ペプチドは、アクセプタービーズに結合している。精製されたGSTタグ付きTPRコシャペロンは、グルタチオン結合ドナービーズと相互作用する。Hsp90由来ペプチドとTPR-モチーフコシャペロンとの相互作用がビーズを一緒に持ち込むとき、増幅シグナルが生成される(図1A)。スクリーニングされた小分子がHsp90とTPR-motifコシャペロンとの相互作用を阻害できる場合、この増幅シグナルは減少する(図1B)。それらのIC50 は、定量測定により算出することができる。このプロトコルは、任意のシャペロンに拡張することができます - TPR-モチーフコシャペロン相互作用は、関心のある、新しい分子の開発において非常に重要であり、特にHsp90とFKBP51またはFKBP52間の相互作用を遮断する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> 図1: 本アッセイの基本原理( A)精製 GST-FKBP51 はグルタチオン結合ドナービーズと相互作用する。Hsp90の極度C末端に対応する10アミノ酸長ペプチドは、アクセプタービーズに結合されている。FKBP51のHsp90由来ペプチドとTPRドメインとの相互作用は、ドナーとアクセプタービーズを近接させます。680 nmでは、ドナービーズの光化剤が酸素を点灯し、酸素を単一酸素に変換します。アクセプティクサビーズ上のチオキセン誘導体は、一重の酸素と反応し、370 nmで化学発光を生成します。このエネルギーは、520-620 nmで発光するために、同じアクセプタービーズ内のフルオロフォアをさらに活性化します。(B)小分子がHsp90とFKBP51の相互作用を阻害すると、ドナーとアクセプタービーズは近接に達することができない。その後、短い寿命の単一の酸素が崩壊し、検出可能な信号が生成されません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)-コカペロン相互作用を標的とすると、Hsp90依存性細胞内プロセスを特異的に調節する可能性が得る。Hsp90のC末流で保存されたMEEVDペンタペプチドは、コシャペロンのテトラトリコペプチド反復(TPR)モチーフとの相互作用を担う。FK506結合タンパク質(FKBP)51およびFKBP52は、異なる機能を有するステロイドホルモン依存性疾患に関与する2つの類似したTPR-モチーフコシャペロンである。したがって、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との間の相互作用を特異的に遮断する分子を同定することは、いくつかのヒト疾患に有望な治療可能性を提供する。ここでは、Hsp90とそのパートナーのコシャペロンFKBP51とFKBP52との相互作用をプローブするための増幅された発光近接均質アッセイのプロトコルについて説明する。まず、TPRモチーフ含有タンパク質FKBP51およびFKBP52をグルタチオンS-トランスファーゼ(GST)タグ付けされた形態で精製しました。GST融合TPR-モチーフタンパク質を有するグルタチオン結合ドナービーズと、Hsp90の10-mer C末端ペプチドと結合したアクセプタービーズを用いて、均質な環境下でタンパク質とタンパク質相互作用を調査した。このアッセイを使用して、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FKBP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。

アッセイでは、Z'因子とS/B比はそれぞれ0.82と13.35(図3A)であり、当社のアッセイは、高スループットスクリーニングに対して堅牢で信頼性が高いことを示しています。その後、それを使用して小さな分子質量化合物をスクリーニングしました。 図3B は、選択された小分子とのシャペロンコカペロン相互作用の用量依存的阻害(D10)を示す。D10の線量応?...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

このプロトコルは、グルタチオン結合ドナービーズとGST融合TPR-モチーフコシャペロンおよびアクセプタービーズとHsp90由来ペプチドを結合してタンパク質とタンパク質相互作用を調べるための技術を提示する。この技術を用いて、Hsp90-FKBP51またはHsp90-FkbP52相互作用を破壊する小分子をスクリーニングし、強力で選択的なHsp90-FKBP51相互作用阻害剤を同定しました。

均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

シャペロンとコカペロンの相互作用を研究するために、均質なビーズベースのアッセイを構築しました。この技術を用いて、Hsp90とFKDP51またはFKBP52間の相互作用を阻害する小分子をスクリーニングし、強力で選択的な阻害剤を同定する。この高スループットのスクリーニング技術は、堅牢で信頼性が高いものです。結果は1時間以内に得ることができ、少量のビーズタンパク質と化合物しか必要としなくていい。このコカペロンとのHsp90相互作用は、アルツハイマー病、癌、自己免疫疾患などのヒト障害に関与していた。この技術は、高い医学的重要性を持つシャペロンコカペロン阻害剤をスクリーニングする機会を提供します。このアッセイの基本原則はここにあります。コカペロンのHsp90C-末端ペプチドとTPRドメインの相互作用がドナービーズとアクセプタービーズを近接させると、高度に増幅されたシグナルが生成されます。インタラクション阻害剤を添加すると、ドナービーズとアクセクタービーズは近接に達することができず、検出可能なシグナルは生成されません。まず、1ミリリットル当たり1ミリグラムでPBS中のHsp90ペプチドを希釈します。PBSで非コンジュゲートアクシータービーズを希釈し、1.5ミリリットルのチューブにビーズを移します。希釈したビーズを洗浄用に遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。結合する場合は、ペプチド中のアクセプタービーズを10~1の比率で設定します。PBS希釈ペプチドにおける淡酸ビーズに、Tween 20およびシアナバラ水素化ナトリウム溶液、および回転シェーカー上の終末撹拌でインキュベートする。未反応部位をブロックするには、pH 8.0の1モルトリス塩酸塩溶液の20マイクロリットルをビーズに加え、摂氏37度で1時間インキュベートして反応を焼き付けます。インキュベーションの終わりに、遠心分離によってビーズを洗浄し、トリス塩酸塩溶液の1ミリリットルでビーズペレットを再懸濁します。洗濯をもう2回繰り返します。最後の洗浄後、貯蔵バッファー内の1ミリリットル当たり1ミリグラムでビーズを再中断し、共役したアクサクサビーズ溶液を光から保護して摂氏4度で保存します。PBSで1ミリリットル当たり10マイクログラムでグルタチオンドナービーズを追加します。1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度にGSTFKBP51を加え、暗闇の中で摂氏25度で10分間反応をインキュベートします。DMSOでテスト化合物のシリアル希釈を行います。384ウェルプレートの各ウェルの隅に0.25マイクロリットルの試験化合物希釈液と三重を加えます。陰性コントロールの場合は、DMSOを0.25マイクロリットル加え、正のコントロールのために、ウェルにHsp90 C末端ペプチドの0.25マイクロリットルを加えます。各ウェルにGSTタグ付きタンパク質を含むグルタチオンドナービーズを含む溶液の22.5マイクロリットルを追加します。手でプレートを十分に振り、摂氏25度で暗闇の中で15分間インキュベートします。取り付けられたHsp90C-末端ペプチドでアクセプタービーズをPBSの0.5倍の1ミリリットル濃度に100マイクログラムに希釈します。各ウェルに希釈アクセクタービーズ2.25マイクロリットルを加えます。デモンストレーションしたように、暗闇の中でプレートを15分間振ってインキュベートします。プレートリーダーの楽器をオンにし、プレートの信号を測定し、テキスト原稿に記載されているようにデータを分析します。ようこそダイアログで X-Y データテーブルを作成し、X 番号、Y を選択し、3 つの反復値を並べて列に入力します。濃度値を X 列に読み込み、信号値を Y 列にインポートします。[解析]をクリックし、変換濃度 X を選択して、対数に変換を選択します。[分析]をクリックし、[X-Y分析]で非線形回帰を選択します。線量応答阻害オプションを開き、対応答変数勾配方程式対対を選択します。[大丈夫]をクリックして、IC50値とグラフを含む結果を表示します。このアッセイは、小分子のスクリーニングに用いられ、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との相互作用を阻害する。Zスコアは0.8以上、バックグラウンド比は13.35で、高スループットスクリーニングの堅牢性と信頼性を発揮します。シャペロンコカペロン相互作用の阻害に対する小分子量試験化合物D10の効果を評価し、IC50値を計算し、そこでD10は用量依存性阻害を示した。Hsp90 GSTFKBP51相互作用のIC50値は65ナノモルであった。一方、Hsp90、GSTFKBP52相互作用については、化合物濃度が最も高い状態では完全な阻害が達成されなかったので、小分子とのタンパク質とタンパク質相互作用の選択的阻害が達成されることを示している。重要なステップは、追加の順序です。まず、小分子とTPRターゲットとの間に複合体を形成します。それ以外の場合は、より長いインキュベーションおよび高い化合物濃度が必要です。この技術を使用して、Hsp90とFKB51またはHsp90とFKB52の相互作用を破壊する小分子をスクリーニングすることができます。また、Hsp90、Hsp70およびコカペロンスクリーニング選択的阻害剤を含むTPRモチーフとの間の任意の相互作用に拡張することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...