Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

이 연구는 스웨덴 연구 위원회 (2018-02843), 브레인 재단 (Fo 2019-0140), 카롤린스카 연구소, 건보르 및 요제프 아네스 재단, 매그너스 베르그발스 재단, 총 및 베르틸 스네스 재단, 토레 닐스 재단, 올드 아펠라 재단, 토르 닐스 재단의 보조금에 의해 지원되었다.

참고: 이 프로토콜에 대한 개요는 그림 2에표시됩니다.
1. GST-FKBP51 및 GST-FKBP52의 발현 및 정제(그림 2A)
<ol><li>
플라스 미드 참고: 이미지 컨소시엄에서 인간 FKBP51(클론 id: 5723416)과 인간 FKBP52(클론 id: 7474554)용 cDNA 클론을 획득합니다.<ol>
<li>인간 FKBP51 DNA를 프라이머로 PCR으로 증폭(앞으로 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', 역전; 5'CTC...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

여기서 우리는 Hsp90과 TPR 모티프 공동 샤페론, 특히 FKBP51 및 FKBP52 사이의 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 선별하기위한 분석방법을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 높은 Z 점수(>0.8)는 높은 처리량 형식의 견고성과 신뢰성을 보여줍니다. 결과는 1 시간 안에 얻을 수 있고, 구슬, 단백질 및 화합물의 소량이 요구됩니다. 또한,이 프로토콜은 쉽게 관심의 TPR 모티프 공동 샤페론 상호 작용 - 모든 Hs...

분자 샤페론은 단백질 접이식, 수송 및 저하를 포함한 단백질 항상성에 기여합니다. 그(것)들은 몇몇 세포 프로세스를 통제하고 암과 신경 퇴행성 질병1과같은 수많은 질병에 연결됩니다. 열 충격 단백질 90 (Hsp90)은 ATP 가수 분해에 의해 구동되는 형태 변화에 의존하고 공동 샤페론2에의해 매개 되는 클라이언트 단백질과 결합하는 가장 중요한 chaperones 중 하나입니다. 치료 대상으로 Hsp90의 명백한 잠재력에도 불구 하 고, 그것의 기능을 미세 조정 하는 것은 큰 도전을 나타냅니다. 임상 시험에서 평가된 N단 ATP 결합 영역을 대상으로 하는 여러 Hsp90 억제제가 있지만, 그 중 어느 것도 마케팅3에대해 승인되지 않았습니다. 잘 정의 된 리간드 바인딩 포켓4의부족으로 인해 Hsp90의 C-말단 영역을 대상으로한 성공 4. 최근, 작은 분자에 의한 Hsp90-cochaperone 상호 작용의 중단은 대체 전략5로조사되고 있다. Hsp90-cochaperone 상호 작용을 표적으로 하는 것은 일반적인 세포 응력 반응을 이끌어 내는 것이 아니라 각종 세포내 프로세스를 구체적으로 통제할 수 있는 가능성을 제공합니다. Hsp90의 C-terminus에서 보존된 MEEVD 펜타펩타이드는 공동 샤페론6의테트라트리코피타이드 반복(TPR) 모티프와의 상호 작용을 담당한다. 인간 단백질 데이터베이스에 주석이 달린 736TPR 모티프 함유 단백질 중 ~20개의 상이한 단백질은 이 펩티드7을통해 Hsp90과 상호 작용한다. MEEVD 펩티드 결합을 위해 경쟁하는 분자는 TPR 도메인을 포함하는 Hsp90과 공동 보호자 사이의 상호 작용을 방해할 것입니다. 펩타이드 결합 부위는 유사한 삼차 구조를 가지고 있지만 다른 TPR 모티프 도메인 간의 전반적인 상동성은 상대적으로 낮은7,Hsp90 및 특정 TPR 모티프 공동 chaperones 사이의 상호 작용을 차단 할 수있는 분자를 식별 할 수있는 기회를 제공. 이들 TPR-모티프 공동-샤페론 중, FK506 결합 단백질(FKBP) 51 및 FKBP52는 스테로이드 호르몬 수용체(SHR)의 조절제이며 암, 스트레스 관련 질환, 대사질환,알츠하이머병등 여러 스테로이드 호르몬 의존성 질환에 관여하고 있다. FKBP51 및 FKBP52 점유율은 80% 시퀀스 유사성을 >, FKBP52는 SHR 활동의 긍정적인 레귤레이터이며, FKBP51은 대부분의경우8의 부정적인 레귤레이터입니다. 따라서, 분자를 식별하는 것은, 특히 Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이 상호 작용을 차단하는, 관련 질병을 위한 유망한 치료 잠재력을 제공합니다.
Mplified Luminescent Promomity Homogenous Assay (AlphaScreen)는 1994년 울만 EF 외9에의해 처음 개발되었다. 지금은 펩타이드 10, 단백질11,DNA12,RNA13및설탕(14)과같은 다양한 유형의 생물학적 상호 작용을 검출하는 데 널리 사용된다. 이 기법에서는, 구슬의 2종류(직경 200nm)가 있고, 하나는 기증자 비드이고 다른 하나는 수용자 비드이다. 생체 분자는 이 구슬에 고정됩니다; 그들의 생물학적 상호 작용은 기증자와 수용자 구슬을 근접으로 가져옵니다. 680 nm에서 기증자 비드의 광감제는 산소를 단일 산소로 조명하고 변환합니다. 단일 산소는 수명이 짧기 때문에 최대 200nm까지만 확산될 수 있습니다. 수용자 비드가 근접한 경우, 티옥센 유도체는 370 nm에서 단일 산소 발생 화학증과 반응합니다. 이 에너지는 520-620 nm15에서빛을 방출하기 위해 동일한 수용자 비드에서 형광을 더욱 활성화합니다. 생물학적 상호 작용이 중단되면 수용자 비드와 기증자 비드는 근접에 도달 할 수 없으므로 단일 산소 붕괴 및 낮은 생성 신호가 발생합니다.
여기서 우리는 Hsp90과 TPR 공동 chaperones, 특히 FKBP51 및 FKBP52 사이 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 검열하기 위한 이 기술을 사용하여 프로토콜을 기술합니다. Hsp90 극한 C-테르미누스에 대응하는 10개의 아미노산 긴 펩티드를 수용자 구슬에 부착한다. 정제 된 GST 태그 TPR 공동 샤페론은 글루타티온 연결된 기증자 구슬과 상호 작용합니다. Hsp90 유래 펩티드와 TPR 모티프 공동 샤페론 간의 상호 작용이 구슬을 함께 가져오면 증폭 된 신호가 생성됩니다(도 1A). 선별된 소분자가 Hsp90과 TPR 모티프 공동 샤페론 간의 상호 작용을 억제할 수 있다면, 이러한 증폭 신호는 감소될것이다(도 1B). IC50은 정량적 측정을 통해 계산할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 보호자로 확장 될 수있다 - TPR 모티프 공동 샤페론 관심의 상호 작용과 특히 Hsp90 과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 차단, 새로운 분자의 개발에 매우 중요하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> 그림 1: 이 분석의 기본 원리. (A)정제된 GST-FKBP51은 글루타티온 연계 기증자 구슬과 상호 작용한다. Hsp90의 극단적인 C-테르미누스에 대응하는 10개의 아미노산 긴 펩티드는 수용자 구슬에 부착된다. FKBP51의 Hsp90 유래 펩티드와 TPR 도메인 간의 상호 작용은 기증자와 수용자 구슬을 근접하게 합니다. 680 nm에서 기증자 비드의 광감제는 산소를 단일 산소로 조명하고 변환합니다. 수용자 비드의 티옥센 유도체는 단일 산소와 반응하여 370 nm에서 화학 발광을 생성합니다. 이 에너지는 동일한 수용자 비드에서 형광을 더 활성화하여 520-620 nm에서 빛을 방출합니다. (B)소분자가 Hsp90과 FKBP51 사이의 상호 작용을 억제할 때, 기증자와 수용자 구슬은 근접에 도달할 수 없다. 그런 다음 짧은 수명 부패를 가진 단일 산소가 발생하며 감지 가능한 신호가 생성되지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

열 충격 단백질(Hsp90)-코차페론 상호작용을 대상으로 하면 Hsp90 의존성 세포내 공정을 구체적으로 조절할 수 있습니다. Hsp90의 C-terminus에서 보존된 MEEVD 펜타펩타이드는 공동 샤페론의 테트라트리코피타이드 반복(TPR) 모티프와의 상호 작용을 담당합니다. FK506 결합 단백질 (FKBP) 51 및 FKBP52는 다른 기능을 가진 스테로이드 호르몬 의존성 질병에 관여하는 두 개의 유사한 TPR-motif 공동 샤페론이다. 따라서, Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 구체적으로 차단하는 분자를 식별하는 것은 몇몇 인간 적인 질병을 위한 유망한 치료 잠재력을 제공합니다. 여기에서는 Hsp90과 파트너 공동 샤페론 FKBP51 및 FKBP52 간의 상호 작용을 조사하기 위해 증폭된 발광 근접 성 균질 분석에 대한 프로토콜을 설명합니다. 먼저, 글루타티온 S-transferase(GST) 태그형태로 TPR 모티프 함유 단백질 FKBP51 및 FKBP52를 정제했습니다. GST 융합 TPR 모티프 단백질과 Hsp90의 10-mer C-말단 펩타이드와 결합된 수용자 구슬을 곁들인 글루타티온 연계 기증자 구슬을 사용하여 동질적인 환경에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사했습니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 분석기를 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

분석에서 Z의 요인과 S/B 비율은 각각 0.82 및 13.35입니다(그림 3A),우리의 분석이 높은 처리량 스크리닝에 강력하고 신뢰할 수 있음을 보여줍니다. 그런 다음 작은 분자 질량 화합물을 검사하는 데 사용했습니다. 도 3B는 선택된 소분자(D10)와 의아페론-코카페론 상호작용의 투여 의존억제를 제시한다. D10에 대한 용량 반응 곡선은 IC50의 값이 계산되...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

우리는 샤페론 코카페론 상호 작용을 연구하기 위해 균일 한 비드 기반의 분석기를 구축했습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 Hsp90과 FKDP51 또는 FKBP52 사이 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 검열하고 강력하고 선택적인 억제제를 확인합니다. 이 높은 처리량 스크리닝 기술은 견고하고 신뢰할 수 있습니다.결과는 1 시간 안에 얻을 수 있고, 단지 구슬 단백질 및 화합물의 소량을 요구합니다. 이 코카페론과의 Hsp90 상호 작용은 알츠하이머 병, 암, 자가 면역 질환과 같은 인간 질환에 연루되었습니다. 이 기술은 높은 의학적 중요성을 가진 보호자 코차페론 억제제를 선별할 수 있는 기회를 제공합니다.다음은 이 분석의 기본 원칙입니다. hsp90C-말단 펩타이드와 코카페론의 TPR 도메인 간의 상호 작용이 기증자와 수용자 구슬을 근접하게 만들면 고도로 증폭된 신호가 생성됩니다. 상호 작용 억제제가 추가되면 기증자 및 수용자 구슬이 근접에 도달할 수 없으며 감지 가능한 신호가 생성되지 않습니다.PBS의 Hsp90 펩티드를 밀리리터 농도당 1밀리그램으로 희석하여 시작합니다. PBS에서 비응유수령구 구슬을 희석하고 구슬을 1.5 밀리리터 튜브로 옮킨다. 희석된 구슬을 원심분리한 다음 상체를 조심스럽게 제거합니다.컨쥬게이팅의 경우, 펩티드에 수용인 비드를 10 대 1의 비율로 설정한다. PBS 희석 펩타이드, Tween 20 및 시아나보로 하이드라이드 용액의 팔레타이드 구슬에, 그리고 회전 셰이커에 끝 이상 동요와 함께 배양. 반응하지 않은 부위를 차단하려면 pH 8.0의 어금니 트리스 염산염 용액 1개 중 20마이크로리터를 구슬에 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 반응을 담금질한다.인큐베이션이 끝나면 구슬을 원심분리로 씻고 트리스 염산염 용액의 1밀리리터에서 비드 펠릿을 다시 중단한다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후, 저장 버퍼에 밀리리터 농도 당 1 밀리그램으로 구슬을 다시 중단하고 빛으로부터 보호되는 4섭씨에 컨쥬게이드 수용자 비드 용액을 저장합니다.PBS에서 밀리리터 농도당 10 마이크로그램의 글루타티온 기증자 구슬을 추가합니다. GSTFKBP51을 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도에 추가하고 어둠 속에서 섭씨 25도에서 10분 동안 반응을 배양합니다. DMSO에서 테스트 화합물의 직렬 희석을 합니다.시험 화합물 희석제의 0.25 마이크로 리터를 추가하고 384 웰 플레이트의 각 웰의 모서리에 삼중 고리를 추가합니다. 음수 제어를 위해, DMSO의 0.25 마이크로리터를 추가하고 양수 제어를 위해, 우물에 Hsp90 C-말단 펩타이드의 0.25 마이크로리터를 추가합니다. GST 태그 단백질을 가진 글루타티온 기증자 구슬을 포함하는 용액의 22.5 마이크로리터를 각 우물에 추가합니다.손으로 접시를 완전히 흔들고 15 분 동안 섭씨 25도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 부착된 Hsp90C-말단 펩타이드로 수용조 비드를 밀리리터 농도당 100 마이크로그램으로 0.5배 PBS로 희석한다. 각 웰에 희석 된 수용자 구슬 2.25 마이크로 리터를 추가합니다.어둠 속에서 접시를 흔들어 15분 동안 배양합니다. 플레이트 판독기 계측기를 켜고, 플레이트의 신호를 측정하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 데이터를 분석한다. 환영 대화 상자에 X-Y 데이터 테이블을 만들고 X 번호, Y를 선택하고 나란히 열에 세 개의 복제 값을 입력합니다.농도 값을 X 열로 가져오고 신호 값을 Y 열로 가져옵니다. 분석을 클릭하고, 농도 X 변환을 선택한 다음, 로개반스로 변환을 선택합니다. X-Y 분석에서 비선형 회귀를 분석하고 선택합니다.용량 응답 억제 옵션을 열고 응답 변수 경사 방정식대 로그를 선택합니다. IC50 값과 그래프가 포함된 결과를 보려면 확인을 클릭합니다. 이 분석은 작은 분자를 선별하기 위해 사용되었으며 Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 억제했습니다.0.8 이상의 Z 점수와 13.35의 배경 비율에 대한 신호는 높은 처리량 스크리닝을 위한 견고성과 신뢰성을 보여줍니다. 작은 분자량 테스트 화합물 D10의 효과가 샤페론-코카페론 상호작용의 억제에 대한 평가및 IC50 값을 계산하였고, 여기서 D10은 용량 의존억제를 보였다. Hsp90 GSTFKBP51 상호 작용에 대한 IC50 값은 65 나노 몰러였습니다.Hsp90의 경우, GSTFKBP52 상호 작용의 경우, 완전한 억제는 가장 높은 화합물 농도로 달성되지 않았기 때문에 작은 분자와의 단백질 단백질 상호 작용의 선택적 억제를 달성할 수 있음을 나타냅니다. 중요한 단계는 추가 순서입니다. 우리는 먼저 작은 분자와 TPR 표적 사이 복합체를 형성합니다.그렇지 않으면 더 긴 잠복및 더 높은 화합물 농도가 필요합니다. 우리는 Hsp90과 FKB51 또는 Hsp90 및 FKB52 사이 상호 작용을 방해하는 작은 분자를 위해 이 기술을 이용할 수 있습니다. 또한 Hsp90, Hsp70 및 코차페론 선별억제제를 함유한 TPR 모티프 간의 상호작용으로 확장할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...