Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (2018-02843), Фонда мозга (Fo 2019-0140), Фонда гериатрических заболеваний в Каролинском институте, Фонда Гунвора и Йозефа Анерса, Фонда Магнуса Бергваллса, Фонда Гана и Бертиля Стонеса, Фонда медицинских исследований Торе Нильссона, Фонда Маргареты аф Угглас и Фонда старых слуг.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого протокола показан на рисунке 2.
1. Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52(рисунок 2A)
<ol><li>
Плазмиды ПРИМЕЧАНИЕ: Получите клоны кДНК для человека FKBP51 (идентификатор клона: 5723416) и для человека FKBP52 (идентификатор к...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

Здесь мы описываем протокол, использующий анализ для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. Его высокий балл Z' (>0,8) демонстрирует надежность и надежность для формата с высокой пропускной способностью. Результаты могу...

Молекулярные шапероны способствуют гомеостазу белка, включая сворачивание белка, транспорт и деградацию. Они регулируют несколько клеточных процессов и связаны с многочисленными заболеваниями, такими как рак и нейродегенеративные заболевания1. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является одним из наиболее важных шаперонов, функция которого зависит от конформационных изменений, вызванных гидролизом АТФ и связыванием с клиентскими белками, опосредованными его ко-шаперонами2. Несмотря на очевидный потенциал Hsp90 в качестве терапевтической мишени, тонкая настройка его функции представляет собой большую проблему. Существует несколько ингибиторов Hsp90, нацеленных на N-концевую область связывания АТФ, которые были оценены в клинических испытаниях, но ни один из них не был одобрен для маркетинга3. Из-за отсутствия четко определенного лигандсвязывающегокармана 4,нацеливание на С-концевую область Hsp90 имело ограниченный успех4. В последнее время нарушение взаимодействий Hsp90-кохаперонов малыми молекулами было исследовано в качестве альтернативной стратегии5. Нацеливание на взаимодействия Hsp90-кохаперонов не вызывает общей реакции клеточного стресса и дает возможность специфически регулировать различные внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов6. Из 736 белков, содержащих мотивы TPR, аннотированных в базе данных белков человека, ~ 20 различных белков взаимодействуют с Hsp90 через этотпептид 7. Молекулы, конкурирующие за пептидное связывание MEEVD, нарушат взаимодействие между Hsp90 и ко-шаперонами, содержащими домен TPR. Сайт связывания пептидов имеет сходную третичную структуру, но общая гомология между различными доменами мотивов TPR относительно низкая7,что дает возможность идентифицировать молекулы, специально способные блокировать взаимодействия между Hsp90 и конкретными TPR-мотивными ко-шаперонами. Среди этих TPR-мотивных ко-шаперонов FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются регуляторами передачи сигналов рецепторов стероидных гормонов (SHR) и участвуют в нескольких стероидных гормонозависимых заболеваниях, включая рак, связанные со стрессом заболевания, метаболические заболевания и болезнь Альцгеймера8. Хотя FKBP51 и FKBP52 имеют > 80% сходства последовательностей, их функции различаются: FKBP52 является положительным регулятором деятельности SHR, в то время как FKBP51 является отрицательным регулятором в большинстве случаев8. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для связанных заболеваний.
Усыпляемый L-умингесцентный Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) был впервые разработан в 1994 году Ullman EF et al.9. В настоящее время он широко используется для обнаружения различных типов биологических взаимодействий, таких какпептид 10,белок11,ДНК12,РНК13и сахар14. В этой технике существует два вида бусин (диаметр 200 нм), один из них является донорской бусиной, а другой - акцепторной бусиной. Биомолекулы иммобилизуются на эти шарики; их биологические взаимодействия приводят к сближению бусин донора и акцептора. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет короткое время жизни, он может диффундировать только до 200 нм. Если шарик акцептора находится в непосредственной близости, его производное тиоксена реагирует с синглетным кислородом, генерируя хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм15. Если биологические взаимодействия нарушаются, акцепторная бусина и донорская бусина не могут достичь близости, что приводит к распаду синглетного кислорода и низкому образуемого сигнала.
Здесь мы описываем протокол, использующий этот метод для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Очищенные GST-помеченные ко-шапероны TPR взаимодействуют с донорскими шариками, связанными с глутатионом. Когда взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и ко-шаперонами TPR-мотива сближает шарики, образуется усиленный сигнал(рисунок 1A). Если экранированные малые молекулы могут ингибировать взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, этот усиленный сигнал будет уменьшен(рисунок 1B). Их IC50 может быть рассчитан путем количественного измерения. Этот протокол может быть распространен на любые интересующих взаимодействия шаперона - TPR-мотива и имеет большое значение в разработке новых молекул, в частности блокирующих взаимодействие между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> Рисунок 1:Основной принцип этого анализа. (A) Очищенный GST-FKBP51 взаимодействует с глутатион-связанными донорскими шариками. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и доменом TPR FKBP51 приближает донорские и акцепторные шарики. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Производное тиоксена на акцепторной бусине реагирует с синглетным кислородом и генерирует хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм. (B) Когда малые молекулы ингибируют взаимодействия между Hsp90 и FKBP51, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости. Затем синглетный кислород с коротким сроком службы распадается, и не вырабатывается обнаруживаемый сигнал. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

Нацеливание на взаимодействие белка теплового шока 90 (Hsp90)-кочаперона дает возможность специфически регулировать Hsp90-зависимые внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов. FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются двумя аналогичными TPR-мотивными ко-шаперонами, участвующими в стероидных гормонозависимых заболеваниях с различными функциями. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для нескольких заболеваний человека. Здесь мы описываем протокол для усиленного люминесцентного равноконтактного однородного анализа для зондирования взаимодействий между Hsp90 и его партнерскими ко-шаперонами FKBP51 и FKBP52. Во-первых, мы очистили TPR-мотив-содержащие белки FKBP51 и FKBP52 в форме, помеченной глутатион S-трансферазой (GST). Используя глутатион-связанные донорские шарики с GST-сплавленными белками TPR-мотива и акцепторными шариками в сочетании с 10-мерным С-концевым пептидом Hsp90, мы исследовали белково-белковые взаимодействия в однородной среде. Мы использовали этот анализ для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

В нашем анализе Z'-фактор и отношение S/B составляют 0,82 и 13,35 соответственно(рисунок 3A),демонстрируя, что наш анализ является надежным и надежным для высокопроизводительного скрининга. Затем мы использовали его для скрининга соединений с малой молекулярной массой. <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay at JoVE.com

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Этот протокол представляет собой метод исследования белково-белковых взаимодействий с использованием глутатион-связанных донорских шариков с GST-сплавленными TPR-мотив-ко-шаперонами и акцепторными шариками в сочетании с пептидом, полученным из Hsp90. Мы использовали этот метод для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

Исследования взаимодействия шаперон-кочаперон с использованием гомогенного бисероплетения

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Мы построили однородный анализ на основе бисера для изучения взаимодействия шаперон-кохаперон. Используя этот метод, мы проверяем небольшие молекулы, ингибирующие взаимодействия между Hsp90 и FKDP51 или FKBP52, и идентифицируем мощные и селективные ингибиторы. Этот высокопроизводительный метод скрининга является надежным и надежным.Результаты могут быть получены в течение одного часа, и для этого требуется лишь небольшое количество белка и соединений бусин. Взаимодействие Hsp90 с этим кохапероном было связано с расстройствами человека, такими как болезнь Альцгеймера, рак, аутоиммунные заболевания. Данная методика дает возможность скрининга ингибиторов шаперона-кохаперона, имеющих высокую медицинскую значимость.Вот основной принцип этого анализа. Когда взаимодействие между Hsp90C-концевым пептидом и доменом TPR кохаперонов приводит к сближению донорских и акцепторных шариков, генерируется сильно усиленный сигнал. Когда добавляются ингибиторы взаимодействия, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости, и не производится обнаруживаемый сигнал.Начните с разбавления пептида Hsp90 в PBS в концентрации одного миллиграмма на миллилитр. Разбавьте неконъюгированные акцепторные шарики в PBS и переложите шарики в 1,5-миллилитровый тюбик. Центрифугируют разбавленные шарики для стирки, а затем аккуратно удаляют супернатант.Для конъюгирования устанавливают акцепторные шарики в пептидах в соотношении 10 к 1. К шарикам палетида на PBS разбавляют пептид, Tween 20 и раствор цианаборогидрида натрия, и инкубируют с сквозным перемешиванием на ротационном шейкере. Чтобы заблокировать непрореагировавые участки, добавьте к шарикам 20 микролитров одного молярного раствора гидрохлорида Триса рН 8,0 и погасите реакцию путем инкубации в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.В конце инкубации промыть шарики центрифугированием и повторно суспендировать гранулу бусины в одном миллилитрах раствора гидрохлорида Триса. Повторите стирку еще два раза. После последней промывки повторно суспендировать шарики при концентрации в один миллиграмм на миллилитр в буфере для хранения и хранить сопряженный раствор акцептора при 4 градусах Цельсия, защищенный от света.Добавьте донорские шарики глутатиона при концентрации 10 микрограммов на миллилитр в PBS. Добавьте GSTFKBP51 к конечной концентрации 10 мкг на миллилитр и инкубируют реакцию в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия в темноте. Производят серийные разбавления исследуемого соединения в ДМСО.Добавьте 0,25 микролитра искомого растворения соединения и утроение в углу каждой лунки плиты из 384 скважин. Для отрицательного контроля добавьте 0,25 микролитра DMSO, а для положительного контроля добавьте 0,25 микролитра пептида Hsp90 C-Terminal в скважины. Добавьте в каждую лунку 22,5 микролитра раствора, содержащего донорские шарики глутатиона с белками, помеченными GST.Тщательно встряхните тарелку руками и высиживание в темноте при 25 градусах Цельсия в течение 15 минут. Разбавляют акцепторные шарики присоединенным пептидом Hsp90C-Terminal до 100 мкг на миллилитр концентрации в 0,5 раза PBS. Добавьте 2,25 микролитра разбавленных акцепторных шариков в каждую лунку.Встряхните и высиживните пластину в темноте в течение 15 минут, как показано на демонстрации. Включите прибор считывателя пластин, измерьте сигнал пластины и проанализируйте данные, как описано в тексте рукописи. Создайте таблицу данных X-Y в диалоговом окне приветствия, выберите X numbers, Y и введите три повторяющихся значения в параллельные столбцы.Импортируйте значения концентрации в столбец X, а значения сигнала в столбец Y. Нажмите кнопку «Анализировать», выберите «Преобразовать концентрацию X», а затем выберите «Преобразовать в логарифмы». Нажмите «Анализировать» и выберите нелинейную регрессию в разделе «Анализ X-Y».Откройте опцию ингибирования реакции дозы и выберите уравнение наклона log и переменной реакции. Нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть результаты, содержащие значение IC50 и графики. Этот анализ использовался для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.Оценка Z более 0,8 и отношение сигнал/фон 13,35 демонстрируют прочность и надежность для скрининга с высокой пропускной способностью. Оценивали влияние маломолекулярного тестового соединения D10 на ингибирование взаимодействий шаперон-кохаперон и рассчитывали значения IC50, где D10 показывал дозозависимое ингибирование. Значение IC50 для взаимодействий Hsp90 GSTFKBP51 составляло 65 наномоляров.В то время как для взаимодействий Hsp90, GSTFKBP52 полное ингибирование не было достигнуто при самой высокой концентрации соединения, что указывает на то, что селективное ингибирование белково-белкового взаимодействия с малыми молекулами может быть достигнуто. Критическим шагом является порядок сложения. Сначала мы формируем комплекс между небольшой молекулой и ее мишенью TPR.В противном случае требуется более длительная инкубация и более высокие концентрации соединений. Мы можем использовать этот метод для скрининга малых молекул, нарушающих взаимодействие между Hsp90 и FKB51 или Hsp90 и FKB52. Он также может быть распространен на любое взаимодействие между Hsp90, Hsp70 и мотивом TPR, содержащим селективные ингибиторы скрининга кохаперона.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Пробоподготовка и относительное количественное определение с использованием восстановительного метилирования аминов для исследований пептидомики

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...