Name: studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación (2018-02843), la Fundación del Cerebro (Fo 2019-0140), la Fundación para Enfermedades Geriátricas en el Instituto Karolinska, la Fundación Gunvor y Josef Anérs, la Fundación Magnus Bergvalls, la Fundación Gun y Bertil Stohnes, la Fundación Tore Nilssons para la investigación médica, la Fundación Margaretha af Ugglas y la Fundación para Viejos Sirvientes.

NOTA: En la figura 2se muestra una descripción general de este protocolo.
1. Expresión y purificación de GST-FKBP51 y GST-FKBP52 (Figura 2A)
<ol><li>
Plasmidios NOTA: Obtenga clones de ADNc para FKBP51 humano (id de clon: 5723416) y para FKBP52 humano (id de clon: 7474554) del consorcio IMAGE.<ol>
<li>Amplificar el ADN FKBP51 humano mediante PCR con cebadores (hacia adelante; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inv...

<ol>
	<li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones.">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li><li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system:+lifting+client+proteins+to+new+heights.">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li><li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors.">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li><li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer.">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li><li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li><li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90.">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li><li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes:+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine.">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li><li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease.">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li><li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay:+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence.">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li><li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions:+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins.">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li><li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates.">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li><li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen(R)+analysis:+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV.">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).</li><li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen.">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan.">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li><li>Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021)</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li></ol>

Aquí describimos un protocolo que utiliza el ensayo para el cribado de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas con motivos TPR, especialmente FKBP51 y FKBP52. Su alta puntuación Z' (>0,8) demuestra la robustez y fiabilidad de un formato de alto rendimiento. Los resultados se pueden obtener en una hora, y se requieren pequeñas cantidades de perlas, proteínas y compuestos. Además, este protocolo podría extenderse fácilmente a cualquier interacción Hsp90 /Hsp70 - TPR-motif ...

Las chaperonas moleculares contribuyen a la homeostasis de las proteínas, incluido el plegamiento, el transporte y la degradación de las proteínas. Regulan varios procesos celulares y están vinculados a numerosas enfermedades como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas1. La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una de las chaperonas más importantes cuya función depende de cambios conformacionales impulsados por la hidrólisis de ATP y la unión con proteínas cliente mediadas por sus co-chaperonas2. A pesar de un potencial obvio de Hsp90 como objetivo terapéutico, ajustar su función representa un gran desafío. Hay varios inhibidores de Hsp90 dirigidos a la región de unión a ATP N-terminal, que han sido evaluados en ensayos clínicos, pero ninguno de ellos ha sido aprobado para su comercialización3. Debido a la falta de un bolsillo de unión al ligando bien definido4,apuntar a la región C-terminal de Hsp90 ha tenido un éxito limitado4. Recientemente, la interrupción de las interacciones Hsp90-cochaperona por moléculas pequeñas se ha investigado como una estrategia alternativa5. Apuntar a las interacciones Hsp90-cochaperona no provocaría una respuesta general al estrés celular y brinda la posibilidad de regular específicamente varios procesos intracelulares. El pentapéptido MEEVD conservado en el extremo C de Hsp90 es responsable de la interacción con el motivo de repetición tetratricopéptido (TPR) de las co-chaperonas6. De las 736 proteínas que contienen motivos TPR anotadas en la base de datos de proteínas humanas, ~ 20 proteínas diferentes interactúan con Hsp90 a través de este péptido7. Las moléculas que compiten por la unión al péptido MEEVD interrumpirían las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas que contienen un dominio TPR. El sitio de unión al péptido tiene una estructura terciaria similar, pero la homología general entre los diferentes dominios de motivos TPR es relativamente baja7,lo que brinda la oportunidad de identificar moléculas específicamente capaces de bloquear las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas particulares con motivos TPR. Entre estas co-chaperonas con motivos TPR, la proteína de unión a FK506 (FKBP) 51 y FKBP52 son reguladores de la señalización del receptor de hormona esteroide (SHR) e involucradas en varias enfermedades dependientes de hormonas esteroides, incluyendo cáncer, enfermedades relacionadas con el estrés, enfermedades metabólicas y enfermedad de Alzheimer8. Aunque FKBP51 y FKBP52 comparten > similitud de secuencia del 80%, sus funciones difieren: FKBP52 es un regulador positivo de la actividad de SHR, mientras que FKBP51 es un regulador negativo en la mayoría de los casos8. Por lo tanto, la identificación de moléculas, bloqueando específicamente las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52, proporciona un potencial terapéutico prometedor para enfermedades relacionadas.
Unensayo amplificado Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) fue desarrollado por primera vez en 1994 por Ullman EF et al.9. Ahora es ampliamente utilizado para detectar diferentes tipos de interacciones biológicas, como el péptido10,la proteína11,el ADN12,el ARN13y el azúcar14. En esta técnica, hay dos tipos de cuentas (diámetro 200 nm), una es la cuenta donante y la otra es la cuenta aceptora. Las biomoléculas se inmovilizan sobre estas cuentas; sus interacciones biológicas ponen en proximidad a las cuentas donantes y aceptoras. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. Debido a que el oxígeno singlete tiene una vida útil corta, solo puede difundirse hasta 200 nm. Si la perla aceptora está en proximidad, su derivado tioxeno reacciona con el oxígeno singlete generando quimioluminascencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm15. Si las interacciones biológicas se interrumpen, la cuenta aceptora y la cuenta donante no pueden alcanzar la proximidad, lo que resulta en la descomposición del oxígeno singlete y la baja señal producida.
Aquí describimos un protocolo que utiliza esta técnica para el cribado de moléculas pequeñas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas TPR, especialmente FKBP51 y FKBP52. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C extremo Hsp90 están unidos a las perlas aceptoras. Las co-chaperonas TPR purificadas marcadas con GST interactúan con las perlas de donantes ligadas al glutatión. Cuando la interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y las co-chaperonas con motivos TPR une las perlas, se produce una señal amplificada(Figura 1A). Si las moléculas pequeñas examinadas pueden inhibir las interacciones entre Hsp90 y las co-chaperonas con motivo tPR, esta señal amplificada disminuirá (Figura 1B). Su IC50 se puede calcular mediante medición cuantitativa. Este protocolo se puede extender a cualquier interacción chaperona - TPR-motivo co-chaperona de interés y es de gran importancia en el desarrollo de nuevas moléculas, bloqueando específicamente la interacción entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg"> Figura 1: El principio básico de este ensayo. (A) GST-FKBP51 purificado interactúa con cuentas de donantes ligadas al glutatión. Los péptidos largos de 10 aminoácidos correspondientes al extremo C-terminal de Hsp90 se unen a las perlas aceptoras. La interacción entre los péptidos derivados de Hsp90 y el dominio TPR de FKBP51 acerca las perlas del donante y del aceptor. A 680 nm, un fotosensibilizador en la cuenta del donante ilumina y convierte el oxígeno en oxígeno singlete. El derivado tioxeno en la perla aceptora reacciona con el oxígeno singlete y genera quimioluminescencia a 370 nm. Esta energía activa aún más los fluoróforos en la misma cuenta aceptora para emitir luz a 520-620 nm. (B) Cuando las moléculas pequeñas inhiben las interacciones entre Hsp90 y FKBP51, las perlas donante y aceptora no pueden alcanzar la proximidad. Luego, el oxígeno singlete con una vida útil corta se descompone y no se produce ninguna señal detectable. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6008350</td>
			<td>Assay volume 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Concentrate protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria shaker Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td>Culture bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP51</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 5723416</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clones for human FKBP52</td>
			<td>Source BioScience</td>
			<td>clone id: 7474554</td>
			<td>pCMV-SPORT6 vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C602003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>9.0.0</td>
			<td>Analysis data and make figures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td>Analysis data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1.02952.1000</td>
			<td>Dilute compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Prepare solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>344504</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-4251</td>
			<td>Elute GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione donor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6765300</td>
			<td>Donor bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-trap column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17528201</td>
			<td>Purify GST-tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Induce protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td>Microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Amplification/PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 column</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Solution exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954648</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-2 vector</td>
			<td>Cytiva (GE Healthcare)</td>
			<td>28954650</td>
			<td>Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire 2300 Multilabel Reader</td>
			<td>Read alpha plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>EnSpire Manager</td>
			<td>Plate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader software protocol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Alpha 384-well Low volume</td>
			<td>Use this protocol to read plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8830</td>
			<td>Prevent proteolysis during sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>As a preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156159</td>
			<td>Activates matrix for coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform</td>
			<td>Peptide 2.0 inc</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize Hsp90 C-terminal peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test-Tube Rotator</td>
			<td>LABINCO</td>
			<td></td>
			<td>Make end-over-end agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>Block unreacted sites of acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Prevent beads aggregation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge Avanti J-20 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Centrifuge to get bacteria cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Microson</td>
			<td></td>
			<td>Sonicate cells to release protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated acceptor beads</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6762003</td>
			<td>Acceptor beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studies of chaperone-cochaperone interactions using homogenous bead-based assay

Dirigirse a las interacciones proteína de choque térmico 90 (Hsp90)-cochaperona proporciona la posibilidad de regular específicamente los procesos intracelulares dependientes de Hsp90. El pentapéptido MEEVD conservado en el extremo C de Hsp90 es responsable de la interacción con el motivo de repetición tetratricopéptido (TPR) de las co-chaperonas. La proteína de unión a FK506 (FKBP) 51 y FKBP52 son dos co-chaperonas similares con motivos de TPR involucradas en enfermedades dependientes de hormonas esteroides con diferentes funciones. Por lo tanto, la identificación de moléculas que bloquean específicamente las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52 proporciona un potencial terapéutico prometedor para varias enfermedades humanas. Aquí, describimos el protocolo para un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada para sondear las interacciones entre Hsp90 y sus co-chaperonas asociadas FKBP51 y FKBP52. En primer lugar, hemos purificado las proteínas FKBP51 y FKBP52 que contienen motivos TPR en forma marcada con glutatión S-transferasa (GST). Utilizando las perlas de donantes ligadas al glutatión con proteínas con motivo tPR fusionadas con GST y las perlas aceptoras junto con un péptido C-terminal de 10 mer de Hsp90, hemos sondeado las interacciones proteína-proteína en un entorno homogéneo. Hemos utilizado este ensayo para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

En nuestro ensayo, el factor Z' y la relación S/B son 0.82 y 13.35, respectivamente(Figura 3A),lo que demuestra que nuestro ensayo es robusto y confiable para el cribado de alto rendimiento. Luego lo usamos para detectar pequeños compuestos de masa molecular. La Figura 3B presenta la inhibición dependiente de la dosis de las interacciones chaperona-cochaperona con una molécula pequeña seleccionada (D10). Las curvas dosis-respuesta para D10 se generan median...

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Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Este protocolo presenta una técnica para sondear las interacciones proteína-proteína utilizando perlas de donantes ligadas al glutatión con co-chaperonas con motivos TPR fusionadas con GST y perlas aceptoras junto con un péptido derivado de Hsp90. Hemos utilizado esta técnica para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Construimos un ensayo homogéneo basado en cuentas para estudiar las interacciones chaperona-cochaperona. Utilizando esta técnica, cribamos pequeñas moléculas que inhiben las interacciones entre Hsp90 y FKDP51 o FKBP52 e identificamos inhibidores potentes y selectivos. Esta técnica de cribado de alto rendimiento es robusta y fiable.Los resultados se pueden obtener dentro de una hora, y solo requiere pequeñas cantidades de proteínas y compuestos de perlas. La interacción de Hsp90 con estas cochaperonas se implicó en trastornos humanos, como la enfermedad de Alzheimer, el cáncer, la enfermedad autoinmune. Esta técnica brinda la oportunidad de detectar inhibidores de chaperona-cochaperona con alta importancia médica.Aquí está el principio básico de este ensayo. Cuando la interacción entre el péptido Hsp90C-Terminal y el dominio TPR de las cochaperonas acerca las perlas del donante y del aceptor, se genera una señal altamente amplificada. Cuando se agregan los inhibidores de la interacción, las perlas donante y aceptora no pueden alcanzar la proximidad y no se produce ninguna señal detectable.Comience diluyendo el péptido Hsp90 en PBS a una concentración de miligramo por mililitro. Diluya las perlas aceptoras no conjugadas en PBS y transfiera las perlas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar las perlas diluidas para lavarlas y luego retirar cuidadosamente el sobrenadante.Para la conjugación, establezca las perlas aceptoras en péptidos en una proporción de 10 a 1. A las perlas de paletida en el péptido diluido PBS, Tween 20 y solución de cianoboroughhidruro de sodio, e incubar con agitación de extremo a extremo en un agitador rotativo. Para bloquear los sitios no reaccionados, agregue 20 microlitros de una solución molar de clorhidrato Tris de pH 8.0 a las perlas, y saciar la reacción incubando durante una hora a 37 grados Centígrados.Al final de la incubación, lave las perlas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet de perlas en un mililitro de solución de clorhidrato Tris. Repita el lavado dos veces más. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas a una concentración de un miligramo por mililitro en el tampón de almacenamiento y guarde la solución de perla aceptora conjugada a 4 grados Celsius protegida de la luz.Agregue perlas de donantes de glutatión a una concentración de 10 microgramos por mililitro en PBS. Agregue GSTFKBP51 a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incube la reacción durante 10 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad. Realice diluciones seriadas del compuesto de prueba en DMSO.Agregue 0.25 microlitros de diluciones de compuestos de prueba y triplique en la esquina de cada pozo de una placa de 384 pozos. Para el control negativo, agregue 0.25 microlitros de DMSO y para el control positivo, agregue 0.25 microlitros de péptido Hsp90 C-Terminal en los pozos. Agregue 22.5 microlitros de la solución que contiene perlas donantes de glutatión con proteínas marcadas con GST a cada pozo.Agite bien el plato con las manos e incube en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 15 minutos. Diluya las perlas aceptoras con el péptido Hsp90C-Terminal unido a 100 microgramos por mililitro de concentración en 0,5 veces PBS. Agregue 2.25 microlitros de perlas aceptoras diluidas a cada pozo.Agitar e incubar el plato en la oscuridad durante 15 minutos como se ha demostrado. Encienda el instrumento lector de placas, mida la señal de la placa y analice los datos como se describe en el manuscrito de texto. Cree una tabla de datos X-Y en el cuadro de diálogo de bienvenida, seleccione números X, Y e introduzca tres valores de réplica en columnas en paralelo.Importe los valores de concentración a la columna X y los valores de señal a la columna Y. Haga clic en analizar, seleccione concentración de transformación X y, a continuación, seleccione transformar en logaritmos. Haga clic en analizar y elija regresión no lineal en Análisis X-Y.Abra la opción de inhibición de la dosis-respuesta y elija la ecuación de pendiente variable logarít registro versus respuesta. Haga clic en Aceptar para ver los resultados que contienen el valor IC50 y los gráficos. Este ensayo se utilizó para el cribado de moléculas pequeñas, inhibiendo las interacciones entre Hsp90 y FKBP51 o FKBP52.La puntuación Z de más de 0,8 y la relación señal-fondo de 13,35 demuestran la robustez y fiabilidad para el cribado de alto rendimiento. Se evaluó el efecto del compuesto de prueba de peso molecular pequeño D10 sobre la inhibición de las interacciones chaperona-cochaperona y se calcularon los valores de IC50, donde D10 mostró inhibición dependiente de la dosis. El valor ic50 para las interacciones Hsp90 GSTFKBP51 fue de 65 nanomolares.Mientras que para Hsp90, las interacciones GSTFKBP52, la inhibición completa no se logró con la mayor concentración de compuestos indica que se puede lograr la inhibición selectiva de la interacción proteína-proteína con moléculas pequeñas. El paso crítico es el orden de adición. Primero formamos un complejo entre una molécula pequeña y su objetivo TPR.De lo contrario, se requiere una incubación más larga y concentraciones de compuestos más altas. Podemos usar esta técnica para detectar moléculas pequeñas que interrumpan la interacción entre Hsp90 y FKB51 o Hsp90 y FKB52. También se puede extender a cualquier interacción entre Hsp90, Hsp70 y un motivo TPR que contenga inhibidores selectivos de detección de cochaperona.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...