Name: optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes
Uploaded: 2022-06-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions EY02665 et EY031706 du National Eye Institute et de l’International Retinal Research Foundation au Dr Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), et une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY, au Département d’ophtalmologie et des sciences visuelles, Université de l’Utah. Le Dr Frans Vinberg est également récipiendaire d’une bourse de développement de carrière de recherche pour prévenir la cécité/Dr H. James et Carole Free, et la Dre Silke Becker d’une subvention ARVO EyeFind. Nous remercions la Dre Anne Hanneken du Scripps Research Institute d’avoir fourni l’œil du donneur utilisé pour les enregistrements illustrés à la figure 2E.

Toutes les expériences utilisant des souris ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel d’études animales de l’Université de l’Utah. Des yeux de porc pour la démonstration de cette vidéo ont été obtenus post-mortem de l’abattoir (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Les yeux ont été obtenus de donneurs humains après une mort cérébrale ou cardiaque avec le consentement à des fi...

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	<li>Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. 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G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).</li><li>Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+phototransduction+and+light+signal+transmission+during+type+2+diabetes.">Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes.</a> BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).</li><li>Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inhibiting+glutamine+synthetase+and+blocking+glutamate+uptake+on+b-wave+generation+in+the+isolated+rat+retina.">Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina.</a> Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).</li></ol>

Développé à l’origine en 1865 par Holmgren pour mesurer les réponses lumineuses rétiniennes de la rétineamphibienne 10, des contraintes techniques ont initialement empêché l’ERG d’être largement utilisé. Néanmoins, des études fondamentales menées par Ragnar Granit et d’autres ont identifié les origines cellulaires de l’ERG et mesuré les réponses des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires ex vivo11,12,13...

L’électrorétinographie mesure la fonction rétinienne en réponse à la lumière1. Il fait partie intégrante de l’étude de la physiologie et de la physiopathologie rétiniennes et de la mesure du succès des thérapies pour les maladies de la rétine. L’ERG in vivo est largement utilisé pour évaluer la fonction rétinienne dans les organismes intacts, mais il présente des limites importantes 2,3. Parmi ceux-ci, l’analyse quantitative des différents types de cellules rétiniennes dans l’ERG in vivo est entravée, car elle enregistre la somme des changements potentiels, et donc des réponses superposées, de toutes les cellules rétiniennes aux stimuli lumineux4. En outre, il ne permet pas facilement l’ajout de médicaments à la rétine, est vulnérable aux influences systémiques et a un rapport signal sur bruit relativement faible. Ces inconvénients sont éliminés dans l’ERG ex vivo qui étudie la fonction de la rétine isolée 2,3,5,6. L’ERG ex vivo permet l’enregistrement de réponses importantes et stables de types de cellules rétiniennes spécifiques par l’ajout d’inhibiteurs pharmacologiques et l’évaluation facile des agents thérapeutiques, qui peuvent être ajoutés au superfusat. En même temps, il élimine les influences des effets systémiques et élimine les bruits physiologiques (par exemple, le rythme cardiaque ou la respiration).
Dans l’ERG ex vivo, les rétines ou les échantillons rétiniens sont isolés et montés côté photorécepteur vers le haut sur le dôme du porte-échantillon 3,5. Le porte-échantillon est assemblé, connecté à un système de perfusion qui alimente la rétine en milieux oxygénés chauffés, et placé sur la scène d’un microscope, qui a été modifié pour délivrer des stimuli lumineux contrôlés par ordinateur. Pour enregistrer les réponses suscitées par la lumière, le porte-échantillon est connecté à un amplificateur, un numériseur et un système d’enregistrement (Figure 1). Cette technique permet d’isoler les réponses des photorécepteurs des bâtonnets et des cônes, des cellules ON-bipolaires et de la glie de Müller en modifiant les paramètres des stimuli lumineux et en ajoutant des agents pharmacologiques.
Une pince patch existante ou une configuration MEA (multi-électrodes array) peut être convertie pour enregistrer l’ERG ex vivo, soit en conjonction avec un adaptateur ERG ex vivo disponible dans le commerce, soit avec un porte-échantillon personnalisé usiné par commande numérique par ordinateur (CNC) en polycarbonate, pour mesurer les réponses lumineuses dans les rétines à partir de petits modèles animaux, tels que des souris. Cette modification augmente l’accessibilité des GRE ex vivo tout en minimisant le besoin d’équipement spécialisé. La conception du porte-échantillon simplifie la technique de montage et intègre des électrodes, éliminant ainsi le besoin de manipuler des microélectrodes par rapport aux méthodes ERG ex vivo transrétiniennes précédemment signalées7. Le taux de perfusion et la température à l’intérieur du porte-échantillon sont des facteurs importants qui affectent les propriétés de réponse des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. En ajustant ces conditions, l’ERG ex vivo peut être enregistré de manière fiable à partir de la rétine isolée de la souris sur des périodes prolongées. Des conditions expérimentales optimisées permettent des enregistrements ERG ex vivo dans des poinçons rétiniens provenant de rétines plus grandes, y compris de grands yeux d’animaux et des yeux de donneurs humains8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mm socket</td>
			<td>WPI</td>
			<td>2026-10</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl Electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EP1</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#39; medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>perfusion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>barium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>potassium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0101</td>
			<td>broad spectrum glutamatergic antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OcuScience Ex Vivo ERG Adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>ex vivo ERG specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer connector</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K222 or 51525K223</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes

Les mesures des réponses lumineuses neuronales rétiniennes sont essentielles pour étudier la physiologie de la rétine saine, déterminer les changements pathologiques dans les maladies de la rétine et tester les interventions thérapeutiques. L’électrorétinogramme ex vivo (ERG) permet de quantifier les contributions de types cellulaires individuels dans la rétine isolée par l’ajout d’agents pharmacologiques spécifiques et l’évaluation des changements tissulaires intrinsèques indépendamment des influences systémiques. Les réponses lumineuses rétiniennes peuvent être mesurées à l’aide d’un porte-échantillon ERG ex vivo spécialisé et d’une installation d’enregistrement, modifiés à partir d’un équipement de pince patch ou de réseau de microélectrodes existant. En particulier, l’étude des cellules ON-bipolaires, mais aussi des photorécepteurs, a été entravée par le déclin lent mais progressif des réponses lumineuses dans l’ERG ex vivo au fil du temps. L’augmentation de la vitesse de perfusion et l’ajustement de la température du perfusat améliorent la fonction rétinienne ex vivo et maximisent l’amplitude et la stabilité de la réponse. L’ERG ex vivo permet uniquement l’étude de types individuels de cellules neuronales rétiniennes. En outre, les améliorations visant à maximiser les amplitudes de réponse et la stabilité permettent d’étudier les réponses lumineuses dans des échantillons de rétine de grands animaux, ainsi que dans des yeux de donneurs humains, faisant de l’ERG ex vivo un ajout précieux au répertoire des techniques utilisées pour étudier la fonction rétinienne.

Ex vivo L’ERG permet d’enregistrer les réponses reproductibles et stables du photorécepteur et de la lumière des cellules ON-bipolaires, par exemple à partir de la rétine de la souris (Figure 2A-C). L’enregistrement des réponses des photorécepteurs des rétines des donneurs humains est possible avec un délai d’énucléation post-mortem allant jusqu’à 5 heures (Figure 2D) et des réponses des cellules ...

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Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

La modification de l’équipement existant de réseau multiélectrodes ou de pince patch rend l’électrorétinogramme ex vivo plus largement accessible. Des méthodes améliorées pour enregistrer et maintenir les réponses lumineuses ex vivo facilitent l’étude du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans la rétine saine, des modèles animaux de maladies oculaires et des rétines de donneurs humains.

Optimisation de la configuration et des conditions de l’électrorétinogramme ex vivo pour étudier la fonction de la rétine dans les petits et grands yeux

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Ce protocole démontre les conditions nécessaires au maintien de la fonction rétinienne dans l’ERG ex vivo, en particulier l’onde B extrêmement sensible produite par les cellules ON-bipolaires. Avec l’ERG ex vivo, nous pouvons mesurer la fonction de différents types de neurones rétiniens avec un rapport signal sur bruit élevé tout en permettant l’introduction facile d’agents pharmacologiques. Cette méthode se prête particulièrement bien à quantifier l’efficacité des agents pharmacologiques sur la fonction rétinienne et la maladie.Pour commencer, convertissez une configuration de réseau multi-électrodes en connectant le porte-échantillon ERG ex vivo à un amplificateur différentiel via une platine de tête. L’amplificateur doit être branché sur l’entrée analogique de la carte d’interface du système multi-électrodes. Utilisez le logiciel d’enregistrement du réseau multi-électrodes pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo.Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et ajoutez une amplification de tension supplémentaire de 10X, en fonction des spécifications du numériseur. Réglez le filtre passe-bas sur 100 hertz. Alternativement, pour convertir une configuration de pince de patch, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un cheval-bas à un amplificateur différentiel, qui doit être connecté à la tête de l’amplificateur de pince de patch.Utilisez le logiciel du système de pince patch et le numériseur pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo. Définissez les paramètres comme indiqué précédemment. Connectez des LED avec les longueurs d’onde appropriées au microscope.Pour contrôler les stimuli lumineux, utilisez un pilote LED contrôlé par des sorties analogiques d’un numériseur. Contrôlez les LED avec un logiciel d’enregistrement qui permettra le déclenchement de stimuli lumineux. Ensuite, calibrez le flux lumineux des LED à la position de la rétine dans le porte-échantillon à l’aide d’une photodiode.Si nécessaire, insérez des filtres de densité neutre pour atténuer l’intensité lumineuse dans le trajet de la lumière. Pour préparer l’électrode, insérez une électrode de pastille de chlorure d’argent dans un connecteur de leurre fileté. Remplissez l’intérieur du connecteur de leurre avec de la colle chaude et insérez une douille de deux millimètres dans la colle chaude du côté non fileté.Souder un fil d’argent de l’électrode EP-1 à la prise de deux millimètres. Vissez l’électrode finie avec un joint torique sur le filetage dans les orifices d’électrode du porte-échantillon ERG ex vivo. Pour les grands yeux, y compris les yeux de donneurs humains, nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et retirez le segment antérieur et le cristallin.Utilisez un scalpel pour faire une coupe à environ trois millimètres du limbe. Insérez des ciseaux de dissection incurvés dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin. Obtenir des échantillons rétiniens pour l’électrorétinographie ex vivo avec un poinçon de biopsie jetable de trois à six millimètres.Pour monter le tissu sur le porte-échantillon, placez la moitié inférieure du porte-échantillon dans une grande boîte de Petri et remplissez-la de milieu d’Ames oxygéné de sorte que le dôme du porte-échantillon soit juste submergé. Saisissez soigneusement le bord de la rétine avec une pince fine et transférez la rétine sur le dôme du porte-échantillon ex vivo, côté photorécepteur tourné vers le haut. Soulevez le porte-échantillon de la solution d’Ames en veillant à ce que la rétine reste en place.Séchez complètement la plaque du porte-échantillon pour minimiser le bruit, la diaphonie électrique et le shunt de signal. Ensuite, assemblez les deux moitiés du porte-échantillon avec quatre vis et connectez la ligne de perfusion. Entraînez l’électrode dans la moitié inférieure du porte-échantillon et connectez le câble anodique au côté interne de la rétine et le câble cathodique au côté photorécepteur.Perfuser le porte-échantillon avec au moins un millilitre par minute de milieu d’Ames oxygéné pendant 10 à 20 minutes pour permettre aux réponses lumineuses de se stabiliser. L’ERG ex vivo a permis l’enregistrement des réponses lumineuses du photorécepteur et des cellules on-bipolaires de la rétine de la souris. L’enregistrement des réponses des photorécepteurs des rétines de donneurs humains a été possible avec un délai d’énucléation post-mortem allant jusqu’à cinq heures et un délai de moins de 20 minutes pour les réponses des cellules ON-bipolaires.Dans des conditions idéales, les amplitudes de réponse et la cinétique dans les deux types de cellules étaient relativement stables au fil du temps, mais ont montré un lent déclin 40 à 45 minutes après le montage de la rétine sur le porte-échantillon. La température réduite dans le porte-échantillon a considérablement ralenti la cinétique des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. Cependant, il a diminué l’amplitude de l’onde B mais pas l’onde A.Inversement, le ralentissement du taux de perfusion a réduit les amplitudes des réponses du photorécepteur et des cellules ON-bipolaires, mais n’a pas affecté le temps implicite de l’onde A ou B. L’arrêt de la perfusion pendant 10 minutes suivi d’une reperfusion a entraîné une perte complète de la fonction des cellules ON-bipolaires avec des réponses photorécepteurs préservées. Une vitesse de perfusion et une température physiologique suffisantes sont essentielles pour obtenir des réponses stables, en particulier des cellules ON-bipolaires dans l’ERG ex vivo.Ce protocole permet d’explorer en profondeur les différences de fonction des photorécepteurs dans la maculaire et la périphérie humaines, répondant à des questions qui ne pouvaient auparavant être posées que chez les primates non humains.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

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Recherche

Neurosciences

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