Name: optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes
Uploaded: 2022-06-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Eye Institute EY02665 und EY031706 und der International Retinal Research Foundation an Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), und einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, New York, NY, an das Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah, unterstützt. Dr. Frans Vinberg erhielt auch einen Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award und Dr. Silke Becker ein ARVO EyeFind-Stipendium. Wir danken Dr. Anne Hanneken vom Scripps Research Institute für die Bereitstellung des Spenderauges, das für die in Abbildung 2E gezeigten Aufnahmen verwendet wurde.

Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Studies Committee der University of Utah genehmigt. Schweineaugen zur Demonstration dieses Videos wurden postmortal aus dem Schlachthof (Sustainable Swine Resources, Johnsonville) erhalten. Die Augen wurden von menschlichen Spendern nach Hirn- oder Herztod mit Zustimmung zur Forschungsnutzung durch die Utah Lions Eye Bank, die San Diego Eye Bank oder Lifes...

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G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).</li><li>Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+phototransduction+and+light+signal+transmission+during+type+2+diabetes.">Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes.</a> BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).</li><li>Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inhibiting+glutamine+synthetase+and+blocking+glutamate+uptake+on+b-wave+generation+in+the+isolated+rat+retina.">Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina.</a> Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).</li></ol>

Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut10 zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Method...

Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht1. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungenauf 2,3. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzhautzellen zu Lichtreizen aufzeichnet4. Darüber hinaus erlaubt es nicht ohne weiteres die Zugabe von Medikamenten zur Netzhaut, ist anfällig für systemische Einflüsse und hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Nachteile werden in der ex vivo ERG eliminiert, die die Funktion der isolierten Netzhaut 2,3,5,6 untersucht. Das ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung großer und stabiler Reaktionen von spezifischen retinalen Zelltypen durch Zugabe pharmakologischer Inhibitoren und einfache Bewertung von Therapeutika, die dem Superfusat zugesetzt werden können. Gleichzeitig beseitigt es Einflüsse systemischer Effekte und eliminiert physiologische Geräusche (z.B. Herzschlag oder Atmung).
Bei der ex vivo ERG werden Netzhäute oder Netzhautproben isoliert und photorezeptorseitig nach oben auf der Kuppel des Probenhalters 3,5 montiert. Der Probenhalter wird zusammengebaut, mit einem Perfusionssystem verbunden, das die Netzhaut mit erhitzten, sauerstoffhaltigen Medien versorgt, und auf den Tisch eines Mikroskops gestellt, das modifiziert wurde, um computergesteuerte Lichtreize zu liefern. Um die durch Licht hervorgerufenen Reaktionen aufzuzeichnen, wird der Probenhalter an einen Verstärker, einen Digitizer und ein Aufzeichnungssystem angeschlossen (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Reaktionen von Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren, ON-Bipolarzellen und Müller-Glia, indem die Parameter der Lichtstimuli verändert und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden.
Eine vorhandene Patchklemme oder ein Multi-Elektroden-Array (MEA) kann in die Aufzeichnung von Ex-vivo-ERG umgewandelt werden, entweder in Verbindung mit einem handelsüblichen Ex-vivo-ERG-Adapter oder einem benutzerdefinierten CNC-bearbeiteten Probenhalter (Computer Numerical Control) aus Polycarbonat, um Lichtreaktionen in Netzhaut von Kleintiermodellen wie Mäusen zu messen. Diese Modifikation erhöht die Zugänglichkeit von ex vivo ERG und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Spezialgeräten. Das Design des Probenhalters vereinfacht die Montagetechnik und integriert Elektroden, wodurch die Notwendigkeit einer Manipulation von Mikroelektroden im Vergleich zu zuvor berichteten transretinalen Ex-vivo-ERG-Methoden entfällt7. Die Perfusionsrate und die Temperatur im Probenhalter sind wichtige Faktoren, die die Reaktionseigenschaften von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen beeinflussen. Durch die Anpassung dieser Bedingungen kann das ex vivo ERG zuverlässig von der isolierten Netzhaut der Maus über längere Zeiträume aufgezeichnet werden. Optimierte experimentelle Bedingungen ermöglichen ex vivo ERG-Aufnahmen in Netzhautstempeln von größeren Netzhäuten, einschließlich großer Tieraugen und menschlicher Spenderaugen8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mm socket</td>
			<td>WPI</td>
			<td>2026-10</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl Electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EP1</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#39; medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>perfusion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>barium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>potassium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0101</td>
			<td>broad spectrum glutamatergic antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OcuScience Ex Vivo ERG Adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>ex vivo ERG specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer connector</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K222 or 51525K223</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes

Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.

Ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung reproduzierbarer und stabiler Photorezeptor- und ON-bipolarer Zelllichtantworten, beispielsweise von der Netzhaut der Maus (Abbildung 2A-C). Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten menschlicher Spendernetzhaut ist mit bis zu 5 h postmortaler Verzögerung der Enukleation (Abbildung 2D) und von ON-bipolaren Zellantworten mit einer Enukleationsverzögerung von <20 min (<strong c...

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Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.

Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Dieses Protokoll zeigt die Bedingungen, die erforderlich sind, um die Netzhautfunktion in ex vivo ERG aufrechtzuerhalten, insbesondere die extrem empfindliche B-Welle, die von ON-bipolaren Zellen erzeugt wird. Mit ex vivo ERG können wir die Funktion verschiedener Arten von retinalen Neuronen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis messen und gleichzeitig die einfache Einführung pharmakologischer Wirkstoffe ermöglichen. Diese Methode ist besonders geeignet, um die Wirksamkeit pharmakologischer Wirkstoffe auf die Netzhautfunktion und -erkrankung zu quantifizieren.Um zu beginnen, konvertieren Sie einen Multi-Elektroden-Array-Aufbau, indem Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe an einen Differenzverstärker anschließen. Der Verstärker muss an den Analogeingang der Schnittstellenkarte des Multi-Elektroden-Array-Systems angeschlossen werden. Verwenden Sie die Aufzeichnungssoftware für das Multi-Elektroden-Array, um die Eingangsdaten des Ex-vivo-ERG aufzuzeichnen und zu speichern.Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und fügen Sie eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung hinzu, abhängig von den Spezifikationen des Digitizers. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hertz ein. Alternativ können Sie zum Umrüsten eines Patchklemmaufbaus den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker verbinden, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden werden muss.Verwenden Sie die Patchklemmsystemsoftware und den Digitizer, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Legen Sie die Parameter wie zuvor gezeigt fest. Verbinden Sie LEDs mit den entsprechenden Wellenlängen mit dem Mikroskop.Um Lichtreize zu steuern, verwenden Sie einen LED-Treiber, der über analoge Ausgänge eines Digitizers gesteuert wird. Steuern Sie die LEDs mit einer Aufnahmesoftware, die das Auslösen von Lichtreizen ermöglicht. Anschließend kalibrieren Sie die Lichtleistung der LEDs an der Position der Netzhaut im Probenhalter mit einer Fotodiode.Setzen Sie bei Bedarf Neutraldichtefilter ein, um die Lichtintensität im Lichtweg zu dimmen. Um die Elektrode vorzubereiten, führen Sie eine Silber-Silberchlorid-Pelletelektrode in einen Gewindeköderanschluss ein. Füllen Sie die Innenseite des Ködersteckers mit Heißkleber und stecken Sie eine zwei Millimeter lange Buchse von der Seite ohne Gewinde in den Heißkleber.Löten Sie einen Silberdraht der EP-1-Elektrode an die zwei Millimeter große Buchse. Schrauben Sie die fertige Elektrode mit einem O-Ring am Gewinde in die Elektrodenanschlüsse des ex vivo ERG-Probenhalters. Bei großen Augen, einschließlich menschlicher Spenderaugen, reinigen Sie die Kugel des verbleibenden Bindegewebes und entfernen Sie das vordere Segment und die Linse.Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt etwa drei Millimeter vom Limbus zu machen. Führen Sie eine gebogene Dissektionsschere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen. Erhalten Sie Netzhautproben für die Ex-vivo-Elektroretinographie mit einem drei bis sechs Millimeter großen Einweg-Biopsiestempel.Um das Gewebe auf dem Probenhalter zu montieren, legen Sie die untere Hälfte des Probenhalters in eine große Petrischale und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem Ames-Medium, so dass die Kuppel des Probenhalters gerade untergetaucht ist. Fassen Sie den Rand der Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette an und übertragen Sie die Netzhaut auf die Kuppel des ex vivo Probenhalters, Photorezeptorseite nach oben. Heben Sie den Probenhalter von der Ames-Lösung ab und achten Sie darauf, dass die Netzhaut an Ort und Stelle bleibt.Trocknen Sie die Platte des Probenhalters vollständig ab, um Rauschen, elektrisches Übersprechen und Signalshunting zu minimieren. Dann montieren Sie beide Hälften des Probenhalters mit vier Schrauben und verbinden Sie die Perfusionsleitung. Treiben Sie die Elektrode in der unteren Hälfte des Probenhalters an und verbinden Sie das Anodenkabel mit der inneren Netzhautseite und das Kathodenkabel mit der Photorezeptorseite.Perfundieren Sie den Probenhalter 10 bis 20 Minuten lang mit mindestens einem Milliliter Ames-Medium pro Minute, damit sich die Lichtreaktionen stabilisieren können. Ex-vivo-ERG ermöglichte die Aufzeichnung von Photorezeptor- und ON-bipolaren Zelllichtreaktionen von der Netzhaut der Maus. Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten von menschlichen Spendernetzhäuten war mit einer Verzögerung der Enukleation von bis zu fünf Stunden post mortem und einer Verzögerung von weniger als 20 Minuten für ON-bipolare Zellantworten möglich.Unter idealen Bedingungen waren Reaktionsamplituden und Kinetik in beiden Zelltypen über die Zeit relativ stabil, zeigten aber 40 bis 45 Minuten nach der Montage der Netzhaut auf dem Probenhalter einen langsamen Rückgang. Eine reduzierte Temperatur im Probenhalter verlangsamte die Kinetik sowohl der Photorezeptoren als auch der ON-Bipolarzellen erheblich. Es verringerte jedoch die Amplitude der B-Welle, aber nicht der A-Welle.Umgekehrt reduzierte die Verlangsamung der Perfusionsrate die Amplituden sowohl der Photorezeptor- als auch der ON-bipolaren Zellantworten, beeinflusste jedoch nicht die implizite Zeit der A- oder der B-Welle. Die Unterbrechung der Perfusion für 10 Minuten, gefolgt von einer Reperfusion, führte zu einem vollständigen Verlust der ON-Bipolarzellfunktion mit erhaltenen Photorezeptorantworten. Eine ausreichende Perfusionsgeschwindigkeit und physiologische Temperatur sind entscheidend für stabile Reaktionen, insbesondere von ON-Bipolarzellen im ex vivo ERG.Dieses Protokoll ermöglicht die eingehende Erforschung der Unterschiede in der Photorezeptorfunktion in der menschlichen Makula und Peripherie und beantwortet Fragen, die bisher nur bei nichtmenschlichen Primaten durchgeführt werden konnten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

Verwenden der Funktion zur Elektroretinogramm im Nager Retina und die schützende Wirkung des Fern Limb ischämischen Präkonditionierung bewerten

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

Tollwut-Nekropsie-Techniken bei großen und kleinen Tieren

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

Im lebenden Organismus Methoden zur Beurteilung der Funktion und Struktur retinaler Ganglienzellen und Sehnerven bei Großtieren

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...